BRAF表達量與神經膠質細胞瘤惡性程度的相關性研究

莫學靚 雷建軍 唐志晗 王佐

BRAF表達量與神經膠質細胞瘤惡性程度的相關性研究

莫學靚 雷建軍 唐志晗 王佐

神經膠質細胞瘤是最常見的原發性顱內腫瘤，其發病機制并不十分清楚。各種原癌基因與抑癌基因的突變或表達量的改變。BRAF基因，與神經膠質細胞瘤的發生密切相關。但BRAF表達量是否與神經膠質細胞瘤的惡性程度相關，未見相關報道，本研究在48例惡性程度不同的神經膠質細胞瘤中，通過免疫組織化學檢測了BRAF基因的表達量改變。結果顯示BRAF基因在惡性程度高的神經膠質細胞瘤中表達量較高，這提示我們BRAF基因的表達量可能可作為腫瘤惡性程度和預后的一個判斷指標，也為干預BRAF基因表達，抑制神經膠質細胞瘤惡變提供了實驗基礎。

神經膠質細胞瘤;BRAF;RAS

神經膠質細胞瘤是最常見的原發性顱內腫瘤［1］，其發病發生原因復雜，可能與原癌基因的突變，拷貝數改變等遺傳因素相關。已有研究證實，EGFR，PDGFRA，PDGF，PDGFR，CDK4，IDH1，IDH2，TP53，CDKN2A，PTEN等基因的突變，缺失或表達量的改變與神經膠質細胞瘤密切相關［2-6］。BRAF，又名鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1，是RAF基因家族成員，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白質激酶類，其活化后可激活MEK(ERK激酶)，向MAPK信號通路下游傳遞細胞有絲分裂信號，導致腫瘤形成。BRAF基因的改變在許多腫瘤中和神經膠質細胞瘤已經報道，但與腫瘤惡性沉淀的的關系報道并不多見，本研究在48例惡性程度不同的膠質細胞中檢測

BRAF的表達變化，探討BRAF表達與神經膠質細胞瘤惡性程度的相關性。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 選取2007年1月至2011年1月間在永州市人民醫院(現更名為永州市中心醫院)行手術切除的48例神經膠質細胞瘤作為研究組，所有病例未進行術前化療。所有病例的診斷依據患者的臨床資料和術后病理的確認。腫瘤切除后用于石蠟包埋進行病理診斷和免疫組織化學檢測。

1.2 臨床資料收集 根據患者的病例資料和病理診斷，詳細記錄以下臨床資料:姓名，性別，年齡，腫瘤大小，腫瘤臨床分期，淋巴轉移，腫瘤分期采用世界衛生組織AJCC分期系統。

1.3 免疫組織化學 采用免疫組織化學方法，神經膠質細胞瘤中BRAF的表達狀況。具體方法如下:常規應用二甲苯脫蠟，梯度酒精脫蠟。蒸餾水新鮮配制3%H2O2室溫下滅活內源性過氧化物酶10 min，蒸餾水洗2 min×3次，微波修復抗原:將切片浸入0.01 m枸櫞酸鹽緩沖溶液(PH6.0)，微波爐中高火加熱5 min，冷卻10 min，自然冷卻，0.1 m PBS洗5 min ×3次，滴加非免疫血清封閉液，室溫下封閉30 min，甩去多余的液體，滴加抗兔源性BRAF抗體(Abcam公司)，4℃濕盒過夜，陰性對照滴加兔IgG，0.1 m PBS洗5 min×3次，分別滴加生物素化抗兔IgG二抗(sigma公司)，37℃放置20 min，0.1 mPBS洗3 min min×3次，辣根酶標記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37℃孵育20 min，0.1 m PBS洗3 min×3次，滴加新鮮配制DAB顯色劑，鏡下控制染色，充分水沖洗終止反應，蘇木素輕度復染，脫水，透明，中性樹脂封片。在保持顯微鏡下相同光強度，每張切片拍攝5個視野的照片。免疫組化染色圖像使用Image J軟件進行分析，進行光密度測定分析，測定平均光密度值。

1.4 統計學方法 利用SPSS 14.0統計軟件進行分析。均數間的比較采用方差分析、獨立樣本t檢驗，數據以均數±標準差(±s)表示。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 一般臨床資料 本研究中共有神經膠質細胞瘤患者48例，其中男性37例，女11例，年齡范圍24歲～71歲(平均54.4±17.2歲)，所有病例均為住院患者并經術后病理確診。根據世界衛生組織分級標準:Ⅰ期3例，Ⅱ期15例(I+Ⅱ期為高分化神經膠質細胞瘤)，Ⅲ期7例，IV期23例(III+IV期為低分化神經膠質細胞瘤)，一般臨床資料見表1。

表1 神經膠質細胞瘤的一般臨床資料

2.2 BRAF基因在低分化的神經膠質細胞瘤中呈現高表達在所有48例神經膠質細胞瘤細胞中，我們使用免疫組織化學的方法檢測了BRAF基因的表達量，結果顯示，BRAF在神經膠質細胞中都呈現胞漿分布，同時，低分化膠質細胞瘤中的信號明顯強于高分化的神經膠質細胞瘤(圖1)。經過統計學分析，兩者具有統計學意義(圖2)。

3 討論

BRAF，又名鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1，是RAF基因家族成員，位于人染色體7q34，包含18個外顯子，編碼分子量為94kD的蛋白質，由783個氨基酸殘基組成，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白質激酶家族，在MAPK信號通路中發揮重要作用［7］。BRAF是RET和RAS的下游蛋白激酶，RET可以與細胞膜上的特異受體結合，激活鳥苷酸結合蛋白RAS的GDP解離而結合GTP，從而活化RAS［8］;活化的RAS進一步與絲/蘇氨酸蛋白激酶BRAF結合，從而激活BRAF，進而磷酸化MAPK激酶，產生聯級反應，最終活化ERKs，轉位進入細胞核。ERKs可以激活核內的轉錄因子如c-fos、c-Jun、Elk-1、cmyc等，從而調節參與細胞增殖與分化的相關基因，在腫瘤發生中產生重要調控作用［9］。

RAS基因突變以及RAS/RAF信號通路的激活在神經膠質細胞瘤中其中重要的作用［10］，本研究在48例神經膠質細胞瘤樣本中，探討了膠質細胞瘤惡性程度與BRAF表達量的相關性。我們的結果提示，惡性程度越高的神經膠質細胞瘤BRAF表達量越高。BRAF的激活有可能激活下游MAPK信號通路，從而引起細胞增殖與分化相關基因表達失調，導致神經膠質細胞瘤的發生。該結果也進一步提示，RAS/BRAF信號通路可能可以作為神經膠質細胞瘤預后的判斷指標［11］。同時，針對BRAF基因作為靶點的治療手段是否能抑制神經膠質細胞瘤的惡性程度還有待進一步研究。

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421001衡陽，南華大學心血管疾病研究所(莫學靚雷建軍 唐志晗 王佐);永州市中心醫院(莫學靚)

圖1 神經膠質細胞瘤標本中BRAF免疫染色(400X)

A:高分化神經膠質細胞瘤，B:低分化神經膠質細胞瘤

圖2 神經膠質細胞瘤組織標本BRAF免疫染色統計結果圖

*:與高分化神經膠質細胞瘤比較P＜0.05