分光光度法測定仙鶴草總酚含量的方法研究

李 倩 劉子衿 葉燕彬 夏 穎 張 楓*

(1.首都醫科大學基礎醫學院，北京 100069;2.首都醫科大學化學生物學與藥學院，北京 100069)

仙鶴草為薔薇科植物龍芽草(agrimonia pilosa ledeb)的地上部分，具有收斂止血、截瘧、止痢、解毒等作用，現代藥理學研究［1］表明其具有較強的抗腫瘤活性。仙鶴草全草中含有仙鶴草素、仙鶴草內酯、甾醇，還含有鞣質、黃酮、仙鶴草酚等多種多酚類物質［2-5］。植物多酚是廣泛存在于植物體內的多羥基酚類化合物的總稱，是植物的次生代謝產物，具有良好的抗氧化、抗誘變、抗腫瘤、抗病毒、抗微生物、抗衰老等多方面作用。于莉等［5-7］的研究已證明仙鶴草多酚具有抗氧化作用，而且仙鶴草的抗腫瘤作用很可能是利用了仙鶴草活性成分中的抗氧化作用。隨著對仙鶴草多酚類物質研究的深入，尋找能夠準確定量測定其多酚的方法是非常必要的。

本研究采取Folin-Ciocalteus法，對仙鶴草中多酚含量的測定條件進行了多方面的實驗，并對所確定的實驗條件從方法學的穩定性、精確性、重復性、回收率等方面進行了考察和驗證。希望本研究所建立的測定方法能為仙鶴草多酚的定量研究以及開發利用提供幫助。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

1)儀器:VIS-7220型-可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司);BSZ型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);FZ102微型植物式樣粉碎機(河北黃驊市齊家務科學儀器廠);HH-601超級恒溫循環水浴(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);TGL-16高速臺式離心機(上海醫用分析儀器廠);KQ-50B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀有限公司)。

2)藥品材料:沒食子酸(中國藥品生物制品檢定所，批號110831-200803);Folin-Ciocalteus試劑(簡稱FC試劑，德國Merck公司);其他試劑為分析純;水為蒸餾水;仙鶴草購自北京市天天好大藥房。

1.2 研究方法

1)標準溶液和樣品溶液的制備:準確稱取沒食子酸5.19mg，用蒸餾水定容于50mL容量瓶中，此為0.104g/L沒食子酸標準溶液。

將干燥后的仙鶴草加入粉碎機中粉碎，并過40目篩，按固液比為1∶30(kg/L)，用60%的乙醇超聲波提取20min。將提取液轉移到離心管中，在轉速1 200r/min離心6min，留取上層清液，此為仙鶴草樣品溶液。

2)測定波長的選擇:分別定量移取沒食子酸標準溶液和仙鶴草樣品溶液于10mL的容量瓶中，依次加入2mL蒸餾水，0.5mL FC試劑，1.5mL 20%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容。放置60min后，以空白為對照，分別用分光光度計在400～800nm范圍內進行掃描，選擇最大吸收波長。

3)顯色溫度和時間的考察:取沒食子酸標準溶液0.3mL于10mL容量瓶中，按照1.2中2)項下方式加入顯色劑，定容后分別放置在 25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃恒溫水浴中加熱反應90min，然后測定760nm和660nm處的吸光度，考察反應溫度對比色效果的影響。

另取0.3 mL沒食子酸標準溶液于10 mL的容量瓶中，按照1.2中2)項下方式加入顯色劑并開始計時。分別在放置 15、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165、180 min時，測定760 nm 和660 nm 處的吸光度，考察反應時間對比色效果的影響。

4)FC試劑和碳酸鈉用量的考察:取沒食子酸標準液 0.6 mL，分別加入 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2 mL 的FC 試劑，1.5 mL 的20%碳酸鈉溶液，并定容于10 mL容量瓶中，室溫反應90 min后測定760 nm和660 nm處的吸光值，確定當20%碳酸鈉用量一定時的FC試劑用量。

另取沒食子酸標準液0.6 mL，加入0.5 mL的FC試劑，分別加入 0.5、0.8、1.2、1.5、1.8、2.1、2.5、3.5 mL的20%碳酸鈉溶液，并定容于10 mL容量瓶中，室溫反應90 min后測定660 nm和760 nm處的吸光值，確定當FC試劑的用量一定時，20%碳酸鈉試劑的用量。

2 結果

2.1 測定波長的確定

從圖1和圖2的吸收曲線可知，顯色后沒食子酸和仙鶴草樣品在750～770 nm，650～700 nm處有吸收峰。因此本實驗選用760 nm和660 nm為其測定波長。

2.2 顯色溫度和時間的確定

由圖3可知，在760 nm和660 nm處，隨著溫度的升高，吸光度有逐漸降低的趨勢，選擇室溫25℃為實驗溫度。

由圖4可知，在加入顯色試劑顯色60 min以后，吸光度在760 nm和660 nm處吸光度基本保持穩定，本實驗選擇90 min為測定時間。

2.3 FC試劑和碳酸鈉用量的確定

由圖5可知，當固定碳酸鈉用量，吸光度大小隨FC試劑量的增加有緩慢的增加，考慮到FC試劑過量后本身的吸收及試劑成本，FC試劑量不是愈大愈好。由圖6可知，當固定FC試劑用量，20%碳酸鈉用量在1.0～1.8 mL內吸光度基本穩定，由于FC試劑與酚類物質反應要在堿性介質條件下進行，如加入的堿量少，顯色反應會不完全。結合這2個實驗結果，本實驗選定FC試劑用量為0.5 mL，20%Na2CO3用量為1.7mL。

2.4 標準曲線的建立

按所確定的實驗方法，準確移取0、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mL沒食子酸標準溶液于10 mL容量瓶中，加入2 mL蒸餾水，0.5 mL FC試劑，1.7 mL 20%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容，室溫放置90 min后，在760 nm和660 nm處分別測定其吸光度。以吸光度為縱坐標，總酚濃度為橫坐標，繪制標準曲線，760 nm時的回歸方程為y=0.091 8x+0.012 9，R2=0.999 3見圖7;660 nm時的回歸方程y=0.084 7x－0.002 6，R2=0.999 7。且均在0～10.4 mg/L有良好的線性關系，詳見圖8。

2.5 方法評價

1)穩定性實驗:取仙鶴草樣品溶液，按所確定的方法加入顯色劑后，每隔15 min測量1次吸光度。180 min內在760 nm的吸光度變化情況為:0.425、0.435、0.437、0.437、0.438、0.438、0.438、0.438、0.438、0.438、0.440、0.438，RSD 為0.9%。在660 nm的吸光度變化情況為:0.379、0.391、0.392、0.393、0.392、0.394、0.394、0.395、0.394、0.395、0.395、0.395，RSD為1.1%。該實驗方法對于仙鶴草樣品在3h之內吸光度是穩定的。

2)重現性實驗:取同1批仙鶴草樣品5份，按所確定的方法測定吸光度，在760 nm的吸光度為0.446、0.449、0.450、0.442、0.444、0.442，RSD 為0.8%。在660 nm的吸光度為0.400、0.405、0.406、0.400、0.400、0.393，RSD 為 1.6%。

3)精密度實驗:取1份仙鶴草樣品，按所確定的方法測定吸光度，重復測定6次，在760 nm測定其吸光度為 0.421、0.431、0.441、0.434、0.437、0.435，RSD為1.6%。在660 nm測定其吸光度為0.380、0.390、0.397、0.389、0.396、0.387，RSD 為 1.6%。

4)加標回收率實驗:采用加標回收實驗，將已知量的沒食子酸樣品，分別加入已知總酚含量的仙鶴草樣品中，按上述所確定的方法進行測定，計算回收率，結果詳見表1。

表1 仙鶴草加標回收率實驗結果Tab.1 Result of recovery of added standard to agrimonia pilosa ledeb

2.6 仙鶴草總酚含量測定

按上述方法制備及測定的7份夏枯草樣品，計算每100克仙鶴草中含有多酚的量分別為:在760 nm處其總酚平均值為4.70 g/100g，RSD為1.0%;在660 nm處總酚平均值為4.75 g/100 g，RSD為1.2%。

3 結論

天然多酚類物質在植物中廣泛存在，不僅種類和數量繁多，而且存在的形式既復雜又多種多樣。所以針對不同的天然物質中的多酚，測定方法可以有多方面選擇，如可采用Folin-Ciocalteus法、Folin-Denis法、鐵氰化鉀法、酒石酸亞鐵法等［8-9］。本文以沒食子酸為對照品，采用Folin-Ciocalteus法測定仙鶴草中的多酚含量。實驗結果表明，在所選定的實驗條件下，無論是采用吸收波長760nm還是660nm，本實驗所建立的測定仙鶴草中總多酚含量的方法，在穩定性、精密性、重復性以及回收率方面都有很好結果，可以為仙鶴草總多酚定量分析的研究方法提供參考。

［1］陽向波.仙鶴草的現代藥理研究進展及臨床研究應用［J］.時珍國醫國藥，2003，14(12):780.

［2］劉紅霞，劉召喜，姜清華，等.仙鶴草的酚類化學成分［J］.沈陽藥科大學學報，2010，29(4):286-289.

［3］賀成，秦文杰，唐曉晶，等.仙鶴草地上部分仙鶴草酚B的分離與鑒定［J］.中草藥，2011，42(2):255-256.

［4］潘婭，劉紅霞，莊玉磊，等.仙鶴草中黃酮類化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2008，33(24):2925-2928.

［5］于莉，金哲雄.仙鶴草中鞣質成分的抗氧化作用［J］.黑龍江醫藥，2008，22(5):625-627.

［6］祝連彩，王伯初，譚君，等.仙鶴草醇提取物極其不同極性部位的抗氧化活性研究［J］.中藥材，2009，32(8):1272-1275.

［7］Zhua L C，Tan T，Wang B C，et al.Antioxidant activities of aqueous extract from agrimonia pilosa ledeb and its fractions［J］.Chem Biodivers，2009(6):1716-1726.

［8］楊佳林，朱青，孫麗萍，等.油菜蜂花酚類化合物含量測定方法的研究［J］.云南農業大學學報，2010，25(1):142-146.

［9］孫宏，張澤.分光光度法測定天然多酚類化合物含量的研究進展［J］.生物質化學工程，2008，42(3):55-58.