遲發(fā)性阿爾茨海默病患者血清尿激酶型纖溶酶原激活因子濃度的測(cè)定及其意義

向紹通 徐書雯* 李東風(fēng)

(1.廣東省人民醫(yī)院東病區(qū)神經(jīng)內(nèi)科廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所廣東省神經(jīng)科學(xué)研究所，廣州 510080;2.廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510080)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種常見(jiàn)的老年異質(zhì)性腦神經(jīng)退行性疾病，以進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能喪失為主要臨床特征，是一種主要的老年癡呆癥，其病理特征以老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)為主。有文獻(xiàn)報(bào)道［1-2］，醫(yī)師如能在患者病理改變尚未達(dá)到不可逆階段時(shí)進(jìn)行早期干預(yù)治療，可延緩或阻止病情發(fā)展，極大地減少AD對(duì)患者及社會(huì)的危害，故AD的早期診斷具有十分重要的意義。但到目前為止，還沒(méi)有獲得一個(gè)一致的、易重復(fù)的、敏感特異性均較高的理想生化標(biāo)志物。β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)的神經(jīng)毒作用是多種因素導(dǎo)致AD發(fā)病的共同通路，血清尿激酶型纖溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator，uPA)是一種類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶，可將無(wú)活性的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為有蛋白水解酶活性的纖溶酶，后者可以降解聚集體或非聚集體形式的Aβ［3］，Alonso D F 等［4］研究發(fā)現(xiàn)，血漿纖溶酶循環(huán)的異常與癡呆的嚴(yán)重程度相關(guān)，尚不知血清uPA濃度與AD的關(guān)系如何，是否可作為AD早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象與納入標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)與分型:①遲發(fā)型阿爾茨海默病(lateonset Alzheimer's disease，LOAD)患者:根據(jù)美國(guó)國(guó)立神經(jīng)病學(xué)、語(yǔ)言溝通障礙和卒中－老年性癡呆和相關(guān)疾病學(xué)會(huì)工作小組標(biāo)準(zhǔn)［5-6］中“很可能AD”的標(biāo)準(zhǔn)納入，簡(jiǎn)易智能精神狀態(tài)量表評(píng)分:文盲≤17分、小學(xué)文化≤20分、初中以上文化≤24分，臨床癡呆評(píng)定量表≥1分，漢密頓抑郁量表評(píng)分＜7分，Hachinski缺血指數(shù)量表評(píng)分≤4分。患者為廣東省人民醫(yī)院東病區(qū)2004年～2007年的門診及住院患者，均為漢族，遲發(fā)病例，相互間無(wú)血緣關(guān)系，共收集55例，男37例，女18例，年齡61～90歲，平均年齡(77.71±7.80)歲。根據(jù)臨床癡呆評(píng)定量表評(píng)分將患者分為輕度、中度和重度:1分為輕度，2分為中度，3分為重度。輕、中、重度癡呆例數(shù)分別為27、15、13例。②對(duì)照組:為廣東省人民醫(yī)院同期體檢人群中記憶及認(rèn)知正常者，共61例，男43例，女18例，年齡66～86歲，平均年齡(75.63±5.10)歲，均為漢族，簡(jiǎn)易智能精神狀態(tài)量表評(píng)分≥28分，漢密頓抑郁量表評(píng)分＜7;Hachinski缺血指數(shù)量表評(píng)分≤4分。年齡、性別均與LOAD組匹配。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

所有研究對(duì)象在獲得同意后，抽全血后制備成血清及提取白細(xì)胞后儲(chǔ)存于－70℃的冰箱。

1.2.2 血清uPA濃度測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)uPA濃度，試劑盒購(gòu)自美國(guó)ASSAYPRO公司。血清樣本用EIA Diluent稀釋液按1∶2稀釋3倍;向微孔加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品或血清樣本，室溫孵育2 h;按說(shuō)明書依次洗板后加入生物素酰化uPA抗體、鏈霉菌抗生物素蛋白－過(guò)氧化物酶結(jié)合物、鉻精底物、中止液，最后用美國(guó)Bio-TEK公司的SvnergyTMHT多通道酶標(biāo)儀于450 nm的波長(zhǎng)讀取溶液的吸光度。所測(cè)濃度×3即為血清uPA濃度。

1.2.3 Plau基因P141L多態(tài)性基因分型［7］

所有入組病例均采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)進(jìn)行plau基因P141L多態(tài)性基因分型，PCR引物:5'-CTGGTTGAGTCTTCCCTGAG-3'及5'-CTGCCACTTCTTCCTTCCCT-3'，引物由日本TaKaRa公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物用AluⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切及電泳。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SASV8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)于病例組與對(duì)照組的年齡構(gòu)成和uPA濃度比較采用t檢驗(yàn)，分層多組比較采用方差分析，對(duì)各組的性別構(gòu)成進(jìn)行χ2一致性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增及酶切產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果

基因型可根據(jù)等位基因的片段來(lái)判斷:C/C型(野生型)為 729 bp;C/T 型為729 bp，594 bp，135 bp;T/T 型為 594 bp，135 bp，詳見(jiàn)圖1。

圖1 Plau基因P141L多態(tài)位點(diǎn)PCR-RFLP電泳圖譜Fig.1 PCR-RFLP electrophoregram of P141L polymorphic of plau gene

2.2 臨床一般資料比較

LOAD組及對(duì)照組性別及年齡構(gòu)成，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，性別比較:χ2=0.14，P=0.708 3;年齡比較:t=1.70，P=0.092 5，詳見(jiàn)表1。

表1 LOAD組和對(duì)照組性別及年齡的比較Tab.1 Comparison of gender and age between LOAD group and control group

2.3 各組血清uPA濃度的比較

將LOAD組進(jìn)一步分成輕度及中－重度兩組，與對(duì)照組進(jìn)行血清uPA濃度的比較，數(shù)據(jù)顯示，中－重度LOAD組血清uPA濃度較輕度LOAD組及對(duì)照組血清uPA濃度低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.85，P=0.469 9)，詳見(jiàn)表2。

表2 LOAD組和對(duì)照組血清uPA濃度的比較Tab.2 Comparison of the concentration of uPA in serum between LOAD group and control group

2.4 Plau基因P141L多態(tài)性對(duì)血清uPA濃度的影響

將所有研究對(duì)象按基因型分為C/C、C/T、T/T 3組，3組血清uPA濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.89，P=0.009 2)，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較分析，C/C組與C/T組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;C/C組與T/T組以及C/T組與T/T組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表明，基因型C/C組及C/T組血清uPA濃度顯著高于T/T組，詳見(jiàn)表3。

表3 所有研究對(duì)象分C/C型、C/T型與T/T型3組血清uPA濃度的比較Tab.3 Comparison of the concentration of uPA in serum among the three genotypes from all subjects

3 討論

uPA是一種類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶，uPA與其特異受體相結(jié)合，可將無(wú)活性的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為有蛋白水解酶活性的纖溶酶。纖溶酶uPA與Aβ的降解密切相關(guān):Ledesma M D等［8］研究表明，纖溶酶可以增加人β淀粉樣蛋白前體蛋白(amyloid protein precursor，APP)在α切割位點(diǎn)上的裂解過(guò)程，從而有效地降低Aβ的分泌。也有體外研究顯示［9］，uPA可以抑制Aβ微纖維的形成，減少Aβ的沉積，從而降低Aβ的毒力。Davis J等［10］報(bào)道，Aβ可以刺激體外培養(yǎng)的人腦血管平滑肌(human cerebro-vascular smooth muscle，HCSM)細(xì)胞中纖溶酶原激活因子的表達(dá)，利用核糖核酸酶保護(hù)測(cè)定和纖溶酶原酶譜分析法可以發(fā)現(xiàn)上述過(guò)程中纖溶酶原激活因子的表達(dá)主要是uPA，并伴隨uPAR表達(dá)的增加;在存在纖溶酶原的情況下，HCSM細(xì)胞中的Aβ被迅速降解，從而恢復(fù)細(xì)胞活力。因此可以認(rèn)為，uPA表達(dá)的增加可以通過(guò)在局部降解或清除致病的Aβ來(lái)發(fā)揮對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用，uPA的異常與AD的病理生理有著密切的聯(lián)系。遺憾的是，本研究利用檢測(cè)了LOAD患者及正常對(duì)照組外周血清uPA的濃度，結(jié)果顯示LOAD組血清uPA的濃度和對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以認(rèn)為血清uPA濃度尚不能用來(lái)作為AD診斷的標(biāo)志物。另外，本研究結(jié)果顯示，輕度LOAD患者血清uPA的濃度較中－重度患者高，雖然差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但可以看出隨著AD患者病情的加重血清uPA的濃度呈遞減的趨勢(shì)。本課題研究人員分析此現(xiàn)象歸納原因有可能因?yàn)?①隨著AD患者病情的發(fā)展，老年斑從只有少許類淀粉樣纖維沉積的早期斑最后可以發(fā)展為中心有致密類淀粉核心的致密斑，隨著AD的病理進(jìn)展，Aβ在腦組織及血管中的沉淀不斷增多。AD患者血漿 Aβ42濃度會(huì)隨之下降［11］。②Tucker H M 等［12］通過(guò)在體外細(xì)胞培養(yǎng)以及APP轉(zhuǎn)基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Aβ聚集體可以增加uPA的mRNA濃度。Davis J等［10］研究也顯示Aβ可以刺激體外培養(yǎng)的人腦血管平滑肌細(xì)胞中uPA的表達(dá)。綜上，隨著血清Aβ濃度的下降，理論上血清uPA的濃度亦會(huì)隨之下降。但近期有研究［13］結(jié)果顯示，AD患者顱內(nèi)的纖溶酶原激活因子的濃度并無(wú)改變，通過(guò)其抑制因子－1來(lái)降低纖溶酶原激活因子的活性。因此，盡管本研究顯示LOAD組血清uPA的濃度和對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，接下來(lái)仍有必要對(duì)LOAD患者血清uPA的活性進(jìn)行研究。

uPA是由位于10號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上的plau基因編碼，Ertekin-Taner N等［14］研究認(rèn)為，位于 plau基因第6外顯子上的錯(cuò)義C→T突變可使脯氨酸變?yōu)榱涟彼?P141L)，此突變可能是一個(gè)致病突變，可通過(guò)減少uPA的濃度，使Aβ42濃度的增加而發(fā)揮作用。本研究分析了plau基因P141L多態(tài)性對(duì)血清uPA濃度的影響，結(jié)果顯示C/T組及C/C組血清uPA濃度顯著高于T/T組，此結(jié)果與Ertekin-Taner N［14］的研究結(jié)果一致。可以認(rèn)為，plau基因第6外顯子上的錯(cuò)義C→T突變可減少血清uPA的濃度，對(duì)探討AD的發(fā)病機(jī)制提供新思路。

［1］Nobili F，Vitali P，Canfora M，et al.Effects of long-term Donepezil therapy on rCBF of Alzheimer's patients［J］.Clin Neurophysiol，2002，113(8):1241-1248.

［2］商秀麗，張鳳英，孟令慧，等.阿爾茨海默病患者血尿酸水平的檢測(cè)及意義［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，38(5):333-334.

［3］Ledesma M D，Abad-Rodriguez J，Galvan C，et al.Raft disorganization leads to reduced plasmin activity in Alzheimer's disease brains［J］.EMBO Rep，2003，4(12):1190-1196.

［4］Alonso D F，F(xiàn)arias E F，F(xiàn)amulari A L，et al.Excessive urokinase-type plasminogen activator activity in the euglobulin fraction of patients with Alzheimer-type dementia［J］.J Neurol Sci，1996，139(1):83-88.

［5］Tiemey M C，F(xiàn)isher R H，Lewis A J，et al.The NINCDSADRDA Work Group criteria for the clinical diagnosis of probable Alzheimer's disease:a clinicopathologic study of 57 cases［J］.Neurology，1988，38(3):359-364.

［6］Blacker D，Albert M S，Bassett S S，et al.Reliability and validity of NINCDS-ADRDA criteria for Alzheimer's disease.The National Institute of Mental Health Genetics Initiative［J］.Arch Neurol，1994，51(12):1198-1204.

［7］向紹通，徐書雯，李東風(fēng).尿激酶型纖溶酶原激活因子基因P141L多態(tài)性與遲發(fā)性阿爾茨海默病的關(guān)系［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29(3):278-282.

［8］Ledesma M D，Da Silva J S，Crassaerts K，et al.Brain plasmin enhances APP alpha-cleavage and Abeta degradation and is reduceed in Alzheimer's disease brains［J］.EMBO Rep，2000，1(6):530-535.

［9］Tucker H M，Kihiko-Ehmann M，Estus S，et al.Urokinase-type plasminogen activator inhibits amyloid-β neurotoxicity and fibrillogenesis via plasminogen［J］.J Neurosci Res，2002，70(2):249-255.

［10］Davis J，Wagner M R，Zhang W，et al.Amyloid beta-protein stimulates the expre-ssion of urokinase-type plasminogen activator(uPA)and its receptor(uPAR)in human cerebrovascular smooth muscle cells［J］.J Biol Chem，2003，278(21):19054-19061.

［11］彭丹濤，許賢豪，禇德發(fā)，等.老年性癡呆患者血漿中β淀粉樣蛋白 Aβ1－42和 Aβ1－40水平與對(duì)照組的對(duì)比研究［J］.中華老年心腦血管病雜志，2004，6(6):371-373.

［12］Tucker H M，Kihiko M，Caldwell J N，et al.The plasmin system is induced by and degrades amyloid-bete aggregates［J］.J Neurosci，2000，20(1):3937-3946.

［13］Fabbro S，Seeds N W.Plasminogen activator activity is inhibited while neuroserpin is up-regulated in the Alzheimer disease brain［J］.J Neurochem，2009，109(2):303-315.

［14］Ertekin-Taner N，Ronald J，F(xiàn)euk L，et al.Elevated amyloid beta protein(Abeta42)and late onset Alzheimer's disease are associated with single nucleotide polymer-phisms in the urokinase-type plasminogen activator gene［J］.Hum Mol Genet，2005，14(3):447-460.