白色念珠菌拮抗酵母菌的分離、篩選及其鑒定

李夢琳，王亞東，林 夢，畢福廣，權春善

(大連民族學院生命科學學院，遼寧 大連 116600)

白色念珠菌(Candida albicans)又稱白假絲酵母菌，廣泛存在于自然界及正常人的口腔、上呼吸道、腸道及陰道中，為常見的條件致病性真菌［1］。機體在菌群失調、免疫力降低等情況下，轉化為致病性念珠菌，引起鵝口瘡、口角炎、陰道炎、肺炎、腸胃炎、心內膜炎、腦膜炎、腦炎、敗血癥等多種疾病。近年來，白色念珠菌已成為醫院真菌感染最常見的致病菌之一，尤其是人體免疫缺陷導致的念珠酵母菌感染成為近年來惡性腫瘤患者死亡的主要原因之一［2］。因此，加強對白色念珠菌感染的治理已不容忽視。目前，治療白念珠菌感染的最常用方法就是使用廣譜抗生素，如制霉菌素、酮康唑、克霉唑等，但這些抗生素的使用造成了菌體的極大抗藥性，致使藥物對白色念珠菌的療效降低或無效，影響惡性血液病患者的治療效果，甚至可以導致患者死亡［3］。本研究通過對構樹果實酵母菌的分離、篩選及初步鑒定，找到了1株能夠有效抑制白色念珠菌生長繁殖的拮抗酵母菌，其拮抗效果穩定、持久，為治療白色念珠菌感染的腫瘤患者等高危人群的新型藥物開發研究提供了依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 構樹果實:采自大連民族學院。白色念珠菌:大連民族學院生命科學學院微生物保藏室提供。

1.1.2 培養基 ①YEPD液體培養基(質量體積比):葡萄糖 0.2%，蛋白胨 0.2%，酵母浸粉0.1%，pH 6.0;②馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基:馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，純水 1.0 L，pH自然;③同化碳源基礎培養基(質量體積比):(NH4)2SO40.5%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸粉0.02%;④同化氮源基礎培養基(質量體積比):葡萄糖2.0%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸粉 0.02%，KNO30.78%，對照組不添加 KNO3而添加(NH4)2SO40.78%;⑤產生類淀粉化合物培養基(質量體積比):(NH4)2SO40.5%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2· 2H2O 0.01%，NaCl 0.01%，葡萄糖3.0%，酵母浸粉 0.1%;⑥糖發酵基礎培養基:干酵母粉6 g，純水1.0 L，pH自然;⑦高滲透壓培養基和麥芽汁液體培養基組成參見文獻［4］。

1.1.3 試劑巰基乙醇、EDTA、K2HPO4、KH2PO4、山梨醇、檸檬酸鈉、蝸牛酶、卡那霉素、Trans8K DNA Marker、RNase A由北京全式金生物技術公司提供，其他試劑均使用分析純。

1.2 方法

1.2.1 構樹果實酵母菌的分離 采摘成熟構樹果實3枚放入無菌錐形瓶中，常溫保存3 d，加入200 mL已滅菌的0.85%氯化鈉，振搖果實至溶液渾濁。然后取 1 mL 分別稀釋 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8倍，從稀釋倍數為10－4開始分別取100 μL涂于含卡那霉素的YEPD固體培養基中，28℃下培養3 d。將形成的不同的菌落進行移種，并挑取單菌落，鏡檢，通過其形態特征，確定其是酵母菌，進行平板劃線純化［5］。

1.2.2 拮抗酵母菌抗菌活性研究 取新培養的白色念珠菌液體培養液稀釋1000倍后，吸取20 μL均勻涂于YEPD固體培養基上［6］，使用打孔器在培養基中間位置打孔，并吸取200 μL新培養的酵母菌培養液于孔內，28℃溫箱中培養3 d后觀察是否出現抑菌圈。

1.2.3 抗白色念球菌酵母菌的鑒定 ①形態特征觀察及培養特征［7-9］:a.細胞形態:將新培養的酵母菌接種于YEPD固體培養基上，置28℃溫箱中培養3 d，用接種環以無菌操作法分別挑取菌落少許，制成水浸片，置顯微鏡下觀察細胞的形態，并測量其大小;b.子囊孢子的形成和形態:在麥芽汁平板上培養3 d后，接種在麥氏培養基上培養1周，然后顯微觀察是否形成子囊孢子;c.培養特征(群體特征):取新培養酵母，移種于麥芽汁液體中，置28℃溫箱中培養3 d后觀察是否發酵，培養液清濁程度，是否形成浮膜、環或島，沉淀物的疏松或緊密等。將酵母菌于YPD固體培養基上28℃培養2 d，用相機對生長出的酵母菌單菌落進行拍照;②生理生化測定:糖發酵測試、碳源同化測試、肌醇同化測試、耐高滲透壓的測試和類淀粉化合物的形成試驗均按照文獻［10-11］;③酵母菌基因組DNA的提取:將酵母菌接種于YEPD液體培養基中，28℃、140 r/min的恒溫搖床過夜培養16～18 h，嚴格控制培養時間，使酵母菌達到對數生長期［12］。吸5 mL菌液分次加入到1.5 mL離心管中，室溫10000 r/min離心1 min，收集菌體，棄上清。加無菌水500 μL洗滌菌體，10000 r/min離心1 min，棄上清后，重復洗滌2次。加500 μL巰基乙醇溶液重懸菌體，37℃水浴處理20 min，期間輕輕顛倒離心管2～3次，10000 r/min離心1 min，棄上清后加入500 μL SCPB緩沖液，懸浮菌體。加過濾除菌后的200 μL蝸牛酶溶液，37 ℃水浴60 min，13000 r/min 離心2 min，棄上清。加SE緩沖液500 μL洗滌沉淀，并吹打懸浮，10000 r/min離心1 min，棄上清，重復洗滌5～6次。加500 μL裂解液，65℃水浴30 min。加5 mol/L KAc溶液200 μL，冰浴60 min 后，4 ℃下12000 r/min離心15 min。將上清轉移至新離心管中，加入等體積酚-氯仿-異戊醇，劇烈震蕩，4℃，12000 r/min離心10 min，吸上清至新離心管中，重復上步一次。加等體積冷異丙醇，－20℃靜置10 min，4 ℃，12000 r/min 離心10 min，棄上清;用70%冷乙醇洗滌沉淀2～3次，室溫晾干沉淀。加TE緩沖液50 μL溶解沉淀后加入5 mg/mL RNase A 2 μL，37 ℃保溫 30 min，自然冷卻后4℃保存［13］;④酵母菌DNA電泳檢測:提取基因組采用瓊脂糖凝膠電泳方法測定樣品中DNA的濃度和純度，提取基因組樣品5 μL上樣于1.0%的瓊脂糖凝膠，Gel Red染色，100 V電壓電泳約30 min，凝膠成像儀下觀察其條帶;⑤PCR擴增18S rDNA片段:采用酵母18S rDNA通用引物擴增目標片斷。擴增正向引物P1序列為5'-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3';反向引物 P2序列為5'-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3'。引物由上海生物工程公司合成，擴增目標產物約為2000 bp。PCR 反應體系(50 μL):10 ×PCR 緩沖液 5 μL，dNTP 4 μL，Taq DNA 聚合酶 0.25 μL，引物各 1 μL，模板 DNA 1 μL，其余用無菌水補足。PCR 反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸3 min，30個循環;72℃延伸10 min［14］。PCR擴增產物經純化并電泳檢測后，由上海英駿生物技術有限公司測序。

1.2.4 系統進化樹的構建和分析 將測得的18S rDNA序列用BLAST軟件在GenBank數據庫中進行相似性搜索，選取同源性較高的序列，用Clustal X 1.81進行多序列比對，利用軟件中的鄰位相接法(Neighbor-Joining)進行聚類分析并構建系統進化樹，重復次數設為1000。

2 結果與分析

2.1 拮抗酵母菌的篩選結果及形態特征

從腐敗構樹果實樣品中進行酵母菌分離純化，得到15株酵母菌，并從中篩選得到1株白色念珠菌的拮抗酵母菌LM-1，其在篩選培養基上能夠產生明顯的抑菌圈(圖1a)。LM-1細胞呈卵圓形、多邊芽殖，具有不同形態的芽細胞(圖1b)，并能進行有性生殖，每個子囊內含子囊孢子3～4個，子囊孢子呈帽形(圖1c)。LM-1菌株在麥芽汁液體培養基中發酵，培養液混濁，不形成浮膜、環和島，錐形瓶底部有較多沉淀，沉淀物緊密;而菌落呈圓形，乳白色，直徑3～4 mm，表面光滑，濕潤稍透明，邊緣整齊，與培養基不結合，單個分散(圖1d)。

圖1 酵母菌LM-1對白色念珠菌的抑制作用和形態特征Fig.1 Antifungal activity and the morphology of the LM-1

2.2 生理和生化鑒定

2.2.1 糖發酵試驗結果 菌株LM-1不能利用葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、棉子糖進行發酵，產生CO2，如表1所示。

表1 糖發酵試驗結果Table 1 The result of sugar fermentation test

2.2.2 碳源、氮源同化及其他生理生化特性 菌株LM-1不能利用葡萄糖、麥芽糖、半乳糖等6種糖類進行發酵，但能同化這6種糖類和糖類以外的有機物，如乙醇、可溶性淀粉等。同時菌株LM-1能同化硝酸鹽和肌醇，但不耐高滲透壓，且可在37℃培養條件下正常生長、繁殖，如表2所示。

2.2.3 類淀粉化合物形成測定 通過向培養液中添加盧戈氏碘液發現，溶液沒有顏色變化，表明該酵母菌沒有合成類淀粉化合物。

2.3 LM-1酵母菌的細胞形態和生理生化鑒定結果

通過與已經鑒定的酵母菌標準菌株菌落和細胞形態相比［15］，LM-1酵母菌與有孢漢遜酵母屬(Hanseniaspora sp.)、擬 威 克 酵 母 屬 (Wickerhamiella sp.)和油脂酵母屬(Lipomyces sp.)親緣關系最近。

表2 碳源、氮源同化及其他生理生化特性Table 2 Carbon and Nitrogen assimilation and other physiological and biochemical characteristics of the isolates

2.4 分子生物學鑒定

2.4.1 LM-1基因組DNA質量檢測 LM-1基因組DNA樣品的電泳結果見圖2所示，提取的基因組條帶整齊明亮，無拖尾現象，說明樣品基因組所含雜質較少，其質量約為50 ng/μL。

2.4.2 LM-1菌株18S rDNA PCR擴增產物的電泳結果 PCR擴增完成后，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果見圖3所示，其基因組擴增后所得的目的片段條帶清晰且較亮，片段大小約為2000 bp 左右［16］。

圖4 菌株18S rDNA序列與其他酵母菌親緣關系進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of LM-1 strain and theirs closest relatives based on 18S rDNA sequence

2.4.3 LM-1酵母菌18S rDNA序列與其他酵母菌親緣關系進化樹的構建 對PCR擴增得到的LM-1菌株18S rDNA的序列進行了測定，并將結果登錄在NCBI GenBank中(登錄號:JX455158)。同源性比對結果表明，LM-1菌與有孢漢遜酵母和假絲酵母的同源性都很高，18S rDNA序列相似程度均達99%。從圖4可知，LM-1菌與Hanseniaspora uvarum的親緣關系最近。綜合分子生物學鑒定結果與上述的形態特征和生理生化鑒定結果，最終將LM-1菌鑒定為有孢漢遜酵母屬［17］。

3 討論

白色念珠菌是重要的人體條件致病性病原真菌，是引起很多疾病的主要原因之一，尤其是免疫力低下的病人，如艾滋病人以及某些進行過器官移植的患者，更易成為深度真菌感染的受害者。近年來，隨著免疫缺陷患者的增多以及新的治療技術的發展，臨床上廣譜抗生素、化療藥物和免疫抑制劑大量使用，真菌感染尤其是深部真菌病發病率逐年增加。自發現第一個抗真菌抗生素灰黃霉素以來，該領域取得了長足的進展，相繼有很多抗真菌藥物用于臨床，但這些藥物的抗菌作用程度、機制以及毒性等不盡相同。雖然已開發了眾多的抗真菌藥物對其進行防治，但由于藥物產生的副作用以及近年出現的耐藥性菌株，促使人們不得不尋找其他新型、有效的抗真菌藥物及先導化合物。

本文從構樹果實中分離拮抗白色念珠菌的酵母菌，通過形態觀察、生理生化和分子生物學鑒定相結合的方法，初步鑒定為有孢漢遜酵母屬。此菌株能夠產生對白色念珠菌具有拮抗作用的物質，影響或限定了病原菌的生存和活動。有孢漢遜酵母屬酵母菌大多用于釀酒和食品工業，還未曾報道具有抗菌活性的有孢漢遜酵母菌。通過LM-1菌株的產生的抗菌活性物質進一步分離純化，并研究其抗菌機制，有助于發現新的抗菌靶點和開發新型真菌藥物。

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