影響茶花炭疽病孢子萌發與附著胞形成的因子

路 梅，葉美娟，凌丹燕，陳文榮

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江 金華 321004)

茶花炭疽病是茶花主要病害之一，由膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起，病癥多出現于葉緣、葉尖和葉脈兩側。初現暗綠色斑紋，后逐漸擴大成不規則大斑，顏色由褐色變為黑色，嚴重時可擴散到整個葉片，引起大量落葉。該病害在浙江省金華地區普遍發生，嚴重影響茶花的觀賞和經濟價值。膠孢炭疽菌可以引起百余種植物發生炭疽病，主要危害葉片和果實，國內外每年都有很多相關研究報道［1-2］，然而，對茶花炭疽病的研究卻鮮有報道。關于該病菌的侵染過程，目前研究一致認為，膠孢炭疽菌的分生孢子先附著于寄主表面，條件適合，產生芽管，繼而在其頂端形成附著胞，隨后侵入寄主表皮細胞［1］。因此，分生孢子萌發率和附著胞形成率的高低成為病原菌侵染寄主成功與否的關鍵。本文將報道實驗室內影響茶花炭疽菌孢子萌發和附著胞形成的主要因子，為進一步闡明病害的發生規律和制定有效的防治措施提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

茶花炭疽病菌株(C.gloeosporioides)由浙江師范大學分子生物學實驗室提供。

1.2 方法

將菌種接種于PDA培養基中，置于25℃生化培養箱中培養5 d，產孢備用。采用“載玻片法”進行孢子的萌發［3］。具體方法如下:在直徑9 cm的培養皿內放置1層濾紙，吸取無菌水將濾紙浸濕，上面放2根玻璃棒，載玻片架在玻璃棒上;將200 μL各種溶液配制的孢子懸浮液(1×105～1×106個/mL)滴在載玻片上，于25℃培養箱中培養;分別在8、12、24 h后取出觀察，計算孢子萌發率和附著胞形成率(孢子萌發率=已萌發的孢子數/總孢子數;附著胞百分率=附著胞數/孢子萌發數)［1］。

1.2.1 不同碳氮源對分生孢子萌發和附著胞形成的影響 分別用0.5%的葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖和硫酸銨、草酸銨、酵母提取物、蛋白胨和硝酸銨溶液配制孢子懸浮液，用Eppendorf移液器分別移取200 μL孢子懸浮液滴于載玻片上，其他試驗處理同上。

1.2.2 不同pH值對分生孢子萌發和附著胞形成的影響 分別用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl溶液配制 pH 值分別為 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13共11種孢子懸浮液，其他試驗處理同1.2.1。

1.2.3 溫度對分生孢子萌發和附著胞形成的影響 用蒸餾水配制1×105～1×106個/mL孢子懸浮液，培養溫度設置為 10、15、20、25、30、35、40℃，觀察溫度對分生孢子萌發和附著胞形成的影響。

1.2.4 光照對分生孢子萌發和附著胞形成的影響 設置連續光照、12 h明12 h暗、12 h暗12 h明、完全黑暗、自然光照5種光照條件，用蒸餾水配制1×105～1×106個/mL孢子懸浮液，其他試驗處理同 1.2.1。

1.2.5 數據分析 以上所有試驗中，每個處理設4個重復，每組試驗重復3次。采用Spss和Excel 2007軟件對實驗所得數據進行數據處理和圖表制作。

2 結果與分析

2.1 不同碳氮源對炭疽菌孢子萌發和附著胞形成的影響

圖1顯示不同碳氮源對炭疽菌孢子萌發的影響。由圖1可知，隨著培養時間的延長，不同處理的孢子萌發率都幅度不同的增加;培養12 h內，不同碳源對孢子萌發率的影響不顯著(P＞0.05);在24 h，影響顯著(P ＜0.05);供試4 種碳源中，葡萄糖處理的孢子萌發率始終高于其他碳源，培養24 h后差異顯著，結果說明葡萄糖能促進孢子的萌發。氮源對茶花炭疽菌孢子的萌發影響研究顯示，分生孢子在草酸銨和硝酸銨中幾乎不萌發;在硫酸銨中少有萌發;在酵母提取物中萌發率最高，蛋白胨僅次之。結果說明，酵母提取物能夠顯著促進孢子的萌發。

圖1 不同碳氮源對炭疽菌孢子萌發的影響Fig.1 The impact of different carbon and sources on anthrax spore germination

不同碳源對附著胞形成影響試驗中，前12 h內所有處理中均未檢測到附著胞;24 h時，檢測到少量的附著胞，麥芽糖、乳糖、葡萄糖和蔗糖處理附著胞的形成率分別為 6.06%、2.16%、1.67%和3.51%，差異不顯著(P ＞0.05)。結果說明，不同的碳源中附著胞的形成需要至少培養12 h以上。而對不同氮源的研究發現，硫酸銨、草酸銨、酵母提取物、蛋白胨和硝酸銨5種氮源處理樣品中，24 h內均未檢測到附著胞的形成，說明5種供試氮源均抑制附著胞的形成。

2.2 不同pH對炭疽菌孢子萌發和附著胞形成的影響

圖2顯示，分生孢子在pH 5～10的溶液中萌發，在pH 3和pH 4的溶液中極少萌發，在pH 11和pH 12的溶液中不萌發;在相同時間內，分生孢子的萌發率在不同的pH溶液中呈正態分布，以pH 7為中點向兩端呈遞減趨勢，萌發率逐漸減小。不同pH對炭疽菌附著胞萌發影響試驗顯示(未附圖)，培養8 h時，未見附著胞;12 h時，在pH 7～10溶液中，檢測到少量的附著胞，形成率均為0.937%;24 h時，pH 5～10溶液中，附著胞形成率為 4.62%、18.54%、6.65%、16.76%、16.59%和14.09%，差異顯著。不同pH值對分生孢子萌發和附著胞形成影響的結果說明，偏酸性的環境有利于孢子的萌發和附著胞形成。但是，孢子萌發和附著胞形成所需的最適pH值略有不同。

圖2 不同pH對炭疽菌孢子萌發的影響Fig.2 The impact of different pH on anthrax spore germination

2.3 不同溫度、光照對炭疽菌孢子萌發和附著胞形成的影響

不同溫度對分生孢子萌發的影響試驗顯示(圖3)，10℃與40℃處理下，孢子不萌發;在相同時間內，20℃處理的孢子萌發率最高。在24 h時，孢子的萌發率由前面的散亂趨向正態分布，不同溫度處理下孢子的萌發率差異顯著;20℃處理的孢子萌發率與其他處理差異顯著，但與25、30、35℃差異不顯著。溫度對附著胞形成影響研究發現，附著胞形成所需的最適溫度同為20℃。研究還發現，20℃處理12 h，孢子的萌發率為53.29%(圖3)，附著胞形成率為16.27%(圖4);24 h，孢子的萌發率為60.67%(圖3)，附著胞形成率為52.88%(圖4)，說明在最適溫度20℃條件下，附著胞的形成滯后于孢子的萌發;且隨著培養時間的延長，附著胞的形成率快速提高，而孢子的萌發率增長較少。

圖3 不同溫度對炭疽菌孢子萌發的影響Fig.3 The impact of different temperature on anthrax spore germination

圖4 不同溫度對炭疽菌附著胞形成的影響Fig.4 The impact of different humidity on appressorium formation of colletotrichum

圖5顯示5種不同光照條件對炭疽菌孢子萌發的影響。由圖5可知，隨著培養時間的延長，各處理孢子的萌發率升高。培養24 h后，12 h光照12 h黑暗處理的孢子萌發率最高，與其他處理差異顯著。由此可見，茶花炭疽菌孢子萌發的最佳光照條件為先進行12 h光照培養再進行12 h黑暗處理。

圖5 不同光照對炭疽菌孢子萌發的影響Fig.5 The impact of different illumination on anthrax spore germination

圖6顯示不同光照條件對炭疽菌附著胞形成的影響。由圖6可知，在不同光照條件下培養8 h，全黑暗、自然光和12 h黑暗12 h光照3種處理下，均未檢測到附著胞;全光照和12 h光照12 h黑暗處理下只檢測到極少量的附著胞。12 h時，全光照和自然光條件下附著胞形成率較高;24 h時，自然光照條件下，附著胞形成率最高，全光照和全黑暗條件下附著胞形成率次之。黑暗光照的交替處理對附著胞形成也有一定的影響。首先，在12 h光照條件下，附著胞形成較低;進入12 h黑暗培養后，附著胞形成率有所提高，但是數值并不顯著。其次，先進行12 h黑暗培養，幾乎不形成附著胞;轉入12 h光照條件后，附著胞形成率顯著提高。

圖6 不同光照對炭疽菌附著胞形成的影響Fig.6 The impact of different illumination on appressorium formation of colletotrichum

2.4 茶花炭疽菌孢子萌發和附著胞形成顯微照片

茶花炭疽菌分生孢子單細胞，長圓筒形或長橢圓形，兩端鈍圓，無色，大小為(150～35)μm×(80 ～35)μm，平均 115.5 μm ×57.5 μm。分生孢子萌發時在孢子中部形成1～2個隔膜，從每個細胞長出1個芽管，芽管頂端形成附著胞。附著胞，圓形，大小平均約60 μm。在薄PDA平板、強光照、溫度適宜的條件下2～3個月后長出呈放射狀扇形的分生孢子器，其分支明顯有隔膜，分生孢子從分生孢子器上單個長出，為無性繁殖階段。茶花炭疽菌形態特征顯微照片見圖7所示。

圖7 茶花炭疽菌形態特征顯微照片Fig.7 Morphological characteristics micrograph of C.gloeosporioide of camellia

3 討論

膠孢炭疽菌(C.glosporioides Penz)是引起植物炭疽病的一類重要植物病原真菌，此菌能引起葉斑、果腐、嫩梢或枝條回枯等癥狀，寄主范圍十分廣泛，給農業生產造成嚴重的經濟損失。本研究首次對碳源、氮源、溫度和光照等條件因子對茶花膠孢炭疽菌分生孢子萌發和附著胞形成的影響進行了系統研究。研究發現，所供試的9種碳氮源中，葡萄糖和酵母提取物能顯著促進孢子萌發，這與柿樹和佛手炭疽菌的研究結果一致［1，4-5］;硫酸銨等5種氮源在24 h內對附著胞形成的抑制作用明顯，目前為止尚未見類似報道，其機理還需進一步的試驗研究。茶花生長適溫在20～25℃，性喜偏酸的土壤。研究還發現，孢子萌發和附著胞形成適宜的溫度和pH與茶花生長所需要的溫度和pH基本一致。由此推測，寄主生長習性符合于病原物的生長周期要求，并且經過長時間的進化，兩者呈趨同的趨勢，對海巴戟炭疽病的研究也驗證了該推測［6］;周而勛等［7］因此建議可在冷涼季節大力發展菜心生產而避開高溫高濕的夏季，以減輕菜心炭疽病的發生和危害。因此，趨同趨勢可能是炭疽菌對農業生產造成嚴重經濟損失的重要原因，破壞其生長周期可以減少相應的損失。

本研究是在實驗室內進行的體外試驗，需進一步的致病性試驗驗證，其結果可能存在一定的差異。張敬澤等［1］研究發現，致病性試驗顯示柿樹炭疽病原菌引起病害所要求的pH范圍比體外試驗結果要窄，暗示了寄主表面微環境可能具有緩沖一定范圍的能力;也有報道［8］，pH能夠調節病原真菌果膠酸鹽裂解酶基因的表達或活性，從而促進對寄主的危害。此外，附著胞的形成是炭疽菌成功侵染的關鍵，有研究報道［7］含疏水基的植物表面、營養饑餓或洋蔥表皮細胞表面可以刺激附著胞形成。茶花炭疽菌是否也存在上述情況，有待于進一步的研究探索。

［1］張敬澤，胡東維.影響柿樹炭疽菌孢子萌發、附著胞形成及致病性的環境因子［J］.植物生理學報，2004，34(2):154-161.

［2］王衛芳，冷懷瓊.柑桔炭疽病菌潛伏侵染的研究、分生孢子萌發和附著胞形成［J］.四川農業大學學報，1991，9(2):200-205.

［3］方中達.植病研究方法［M］.北京:中國農業出版社，2007，152-153.

［4］Estrada A B，Dodd J C，Jeffries P.Effect of humidity and temperature on conidial germination and apperssorium development of two Philippine isolates of the mango anthracnose pathogen Colletotrichum gloeosporioides［J］.Plant Pathology，2000，49(5):608-618.

［5］路梅，楊佳妮，周端頊，等.佛手炭疽病病原菌生物學特性研究［J］.浙江師范大學學報，2011，34(3):323-327.

［6］蔡志英，劉昌芬，藍增全，等.西雙版納海巴戟炭疽病和病原菌分生孢子萌發、附著胞形成條件的研究［J］.植物保護，2009，35(1):90-93.

［7］周而勛，楊媚，張華，等.菜心炭疽病菌菌絲生長、產孢和孢子萌發的影響因素［J］.南京農業大學學報，2002，25(2):47-51.

［8］Yakoby N.Kobiler I，Dinoor A，et al.pH regulation of pectate lyase secretion modulates the attack of Colletotrichum gloeosporioides on avocado fruits［J］.Appl.Environ.Microbiol.，2000，66(3):1026-1030.