響應(yīng)面法優(yōu)化趨磁細(xì)菌AMB-1產(chǎn)磁小體的條件

陶玉貴，孫憶晨，曹 寧，葛 飛

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

磁性納米顆粒作為一種納米材料在生物技術(shù)和生物制藥等領(lǐng)域已顯出良好的應(yīng)用前景［1］，如生物活性物質(zhì)的固定和修飾，靶向藥物以及生物活性物質(zhì)的檢測(cè)等［2-3］。合成生物相容磁性納米微粒的方法主要有共沉淀法［4］、氣溶膠法［5］、微乳液法［6］等。但是物理或化學(xué)方法制備的磁性納米顆粒尺寸分布較寬、在溶液中易發(fā)生聚集，使其失去納米材料所特有的性質(zhì)［7］。因此，通過生物方法得到粒徑分布范圍窄、操作簡(jiǎn)單和成本低的磁性納米顆粒是人們關(guān)注的重點(diǎn)［8］。趨磁細(xì)菌是一類能夠?qū)h(huán)境中鐵元素礦化為積累在細(xì)胞內(nèi)由生物膜包被的、納米尺寸、單磁疇級(jí)別晶體顆粒的微生物［9］，由該方法得到磁性納米顆粒能夠很好地滿足較窄的粒徑分布范圍等要求［10-11］，是一種非常理想的納米載體［12］。目前的研究表明，大多數(shù)趨磁細(xì)菌需要在微好氧或厭氧條件下生長(zhǎng)，且營養(yǎng)條件要求苛刻［13］，因此在實(shí)驗(yàn)室中能夠分離純化得到的細(xì)菌種類很少，限制了對(duì)其的進(jìn)一步研究。Magnetospirillum sp.AMB-1是 Matsunaga等［14］從日本東京天然淡水泉沉積物中分離得到的1株螺旋形趨磁細(xì)菌，是目前為數(shù)不多的幾種能在實(shí)驗(yàn)室條件下大量培養(yǎng)的細(xì)菌，其耐氧度高，能夠利用三羧酸循環(huán)的中間體作為生長(zhǎng)所需的碳源，并可在微好氧或厭氧條件下合成Fe3O4型磁小體。但由于其所需的生長(zhǎng)條件較為苛刻，因此，大量的純種培養(yǎng)及合成較多的磁小體仍然是目前亟待解決的問題［15］。本文在前期所做的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化趨磁細(xì)菌Magnetospirillum sp.AMB-1產(chǎn)磁小體的條件，所有的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理以及響應(yīng)面模型的建立均使用SAS軟件進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 趨磁細(xì)菌 Magnetospirillum sp.AMB-1，購于美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏所，菌種編號(hào)為ATCC700264。

1.1.2 培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基，均為MSGM 培養(yǎng)基［16］。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 ①平板培養(yǎng):將趨磁細(xì)菌Magnetospirillum sp.AMB-1進(jìn)行平板培養(yǎng)，30℃條件下培養(yǎng)96 h;②種子培養(yǎng):250 mL錐形瓶中裝入種子培養(yǎng)基125 mL，接入平板培養(yǎng)基上的細(xì)菌，30℃下培養(yǎng)4 d;③發(fā)酵培養(yǎng):通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的添加量，于250 mL錐形瓶中裝入125 mL培養(yǎng)基，并按2%的接種量，在不同培養(yǎng)條件下依次進(jìn)行Plackett-Burman、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) ①Plackett-Burman實(shí)驗(yàn):根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取6個(gè)影響因素，進(jìn)行8次實(shí)驗(yàn)，并對(duì)其重要性進(jìn)行篩選(自變量、編碼和水平因素見表1);②最陡爬坡實(shí)驗(yàn):根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)最陡爬坡路徑，增加或減少重要因素在培養(yǎng)基中的濃度，其余因素均為初始水平，考察發(fā)酵液中菌體量與磁小體形成量的變化趨勢(shì)，確定重要因素的最適濃度范圍［18-19］;③Box-Behnken實(shí)驗(yàn):以Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選得到的對(duì)發(fā)酵液中菌體量和磁小體形成量影響顯著的因素作為設(shè)計(jì)因素，以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)得到的最佳條件為中心點(diǎn)，根據(jù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用SAS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析(見表2)。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 The two levels of variables used in the Plackett-Burman design

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 2 Levels of variables used in the Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，并采用SAS軟件對(duì)表3中的菌種量和磁小體形成量進(jìn)行回歸分析，得到各影響因素的偏回歸系數(shù)及其顯著性(見表4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，奎尼酸鐵添加量、培養(yǎng)溫度和pH值對(duì)菌種濃度影響較大，且影響均為正效應(yīng)。而pH和培養(yǎng)溫度對(duì)磁小體形成量并無太大影響，奎尼酸鐵添加量對(duì)其影響呈現(xiàn)正效應(yīng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合考慮，選擇奎尼酸鐵添加量、pH和溫度進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 3 Plackett-Burman experimental design and response values

表4 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析Table 4 Partial regression coefficients and analysis of their significances

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定最佳濃度范圍

如表5所示，在奎尼酸鐵添加量為 0.25 μmol，培養(yǎng)溫度為32℃，pH為6.7的實(shí)驗(yàn)條件下，趨磁細(xì)菌量和磁小體形成量均達(dá)到最大值，以該實(shí)驗(yàn)條件作為中心點(diǎn)，進(jìn)行下一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表5 最陡爬坡路徑實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 The path of steepest ascent experimental design and response values

2.3 利用響應(yīng)面分析法確定最佳實(shí)驗(yàn)條件

以奎尼酸鐵添加量、培養(yǎng)溫度和pH 3個(gè)重要因素為自變量，各個(gè)因素水平見表2，Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表6所示。

表6 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Box-Behnken experimental design and response values

根據(jù)表6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用SAS軟件處理后得到回歸方程。菌種濃度的回歸方程:Y1=0.974667+0.00025 × A+0.005375 × B-0.00375×C-0.008208×A ×A+0.0005×A ×B+0.0025×A ×C-0.022458×B ×B-0.00325×B ×C-0.039458×C ×C

磁小體形成量的回歸方程:Y1=1.782333+0.0035 × A+0.004375 × B-0.003875 × C-0.003417×A×A+0.00075 ×A ×B+0.00125×A×C-0.017667×B ×B-0.0025×B ×C-0.050167×C ×C。

其中A、B、C分別代表奎尼酸鐵添加量、pH值和培養(yǎng)溫度(表7)。方差分析顯著性結(jié)果表明，R2分別為99.62%和99.03%，方程的回歸性顯著。

表7 回歸分析結(jié)果Table 7 Results of regression equation analysis

利用SAS軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到各響應(yīng)面立體分析圖(圖1，圖2)。對(duì)上述2個(gè)回歸方程求偏導(dǎo)，得到模型極值點(diǎn)，綜合考慮后取奎尼酸鐵添加量、培養(yǎng)溫度和pH分別為2.7 μmol，32 ℃和 6.8，該條件下菌體濃度和磁小體形成量達(dá)到最大值。

圖1 因素對(duì)菌體濃度交互影響三維曲面圖Fig.1 Surface of mutual-influence on the yield of magnetotacic bacteria AMB-1

圖2 因素對(duì)磁小體形成量交互影響三維曲面圖Fig.2 Surface of mutual-influence on the production of magnetosomes

2.4 優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型的正確性，在預(yù)測(cè)的最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行了3次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，所得的菌體濃度和磁小體形成量分別為 0.980 à、1.782，與預(yù)測(cè)值接近，說明該模型能夠很好地預(yù)測(cè)其發(fā)酵情況。

3 討論

采用響應(yīng)面分析法對(duì)趨磁細(xì)菌產(chǎn)磁小體的條件進(jìn)行優(yōu)化，首先運(yùn)用Plackett-Burman法確定出奎尼酸鐵添加量、初始pH和培養(yǎng)溫度為重要影響因素，然后通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逐步改變?nèi)叩臐舛龋平罴秧憫?yīng)面區(qū)域;最后采用Box-Behnken設(shè)計(jì)及SAS軟件分析確定除了主要影響因素的最佳濃度，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為奎尼酸鐵添加量 2.7 μmol、培養(yǎng)溫度 32℃ 和 pH 6.8。同時(shí)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，通過回歸方程所得到的最大預(yù)測(cè)值與驗(yàn)證值非常接近，說明該回歸方程能夠比較真實(shí)地反映各篩選因素對(duì)培養(yǎng)條件的影響，由此方法建立的模型與實(shí)際情況比較吻合，從對(duì)Cmag值測(cè)定的結(jié)果表明Cmag值與菌體濃度存在一定的關(guān)系，當(dāng)菌體濃度增加時(shí)，單位發(fā)酵液中所含有的磁小體量也有一定程度的增加，因此用響應(yīng)面法優(yōu)化趨磁細(xì)菌產(chǎn)磁小體條件是可行的。

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