硫化氫對大鼠腸缺血再灌注后回腸收縮活性的保護作用

張觀坡 高 峻 李桂香 李兆申 鄒多武*

第二軍醫大學長海醫院消化內科（200433）

腸缺血再灌注（ischemia-reperfusion,I/R）損傷是臨床上較為常見的基本病理生理過程，可在出血性休克、小腸移植、機械性腸梗阻和嚴重外傷等過程中發生[1]，會引起嚴重的并發癥甚至死亡，但目前仍缺乏有效的治療藥物。硫化氫（hydrogen sulfide,H2S）是一種繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三類氣體信號分子，包括人在內的哺乳動物可代謝生成內源性H2S。Liu等[2]和Henderson等[3]均證實腸缺血后再灌注前給予H2S，可減輕I/R對腸黏膜上皮的損傷。目前尚未見H2S能否保護I/R后腸運動功能的報道。本研究通過探討H2S對腸I/R后回腸收縮活性的影響及其機制，旨在為腸I/R的治療提供一種潛在的藥物。

材料與方法

一、實驗動物、主要儀器、試劑

24只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠由第二軍醫大學實驗動物中心提供，體質量180～250 g，適應性飼養1周。

BL-420S生物機能實驗系統、HV-4離體組織器官恒溫灌流系統、普通刺激銀電極（成都泰盟軟件有限公司），JH-2肌張力傳感器（航天醫學工程研究所），IX71 熒光倒置顯微鏡（Olympus公司）。KCl（上海凌峰化學試劑有限公司），乙酰膽堿（Ach）、硫氫化鈉（NaHS）、河豚毒素（TTX）（Sigma 公司），驢封閉血清（Invitrogen公司），小鼠抗Hu單克隆抗體（Molecular Probes），山羊抗膽堿乙酰轉移酶（ChAT）多克隆抗體（Millipore），488 標記的驢抗小鼠熒光二抗（Invitrogen公司），Cy3標記的驢抗山羊熒光二抗（Jackson ImmunoResearch）。

二、方法

1.腸I1h/R4h模型的制備：SD大鼠禁食不禁水18 h，7%水合氯醛腹腔內注射麻醉，開腹分離腸系膜上動脈并用無創動脈夾夾閉，可見腸系膜上動脈分支遠端搏動消失，小腸由紅色轉變為白色漸而轉變為深藍色。1 h后開腹取下動脈夾，可見腸系膜上動脈恢復前向性血流，遠端分支出現動脈搏動，小腸由深藍色恢復為紅色，合并充血、水腫。縫合腹腔，再灌注 4 h[4]。

2.動物分組和實驗設計：將24只SD大鼠隨機分為正常組、假手術組、I/R組、H2S組,每組各6只。正常組麻醉后直接取材；假手術組麻醉開腹后僅用器械翻動小腸；I/R組行腸I1h/R4h造模，再灌注前20 min予腹腔內注射0.9%NaCl溶液（0.5 mL/100 g）；H2S組行腸I1h/R4h造模，再灌注前20 min予腹腔內注射2 mmol/L NaHS溶液（0.5 mL/100 g，終濃度為 10 μmol/kg）。

三、功能學實驗

1.組織取材：SD大鼠以7%水合氯醛麻醉后開腹，距回盲部3 cm處取回腸2～3 cm，立刻置入冷的 KRB 液中（通 95%O2、5%CO2混合氣體），修剪成1.0～1.5 cm的腸段。

2.離體回腸自發收縮實驗：腸段垂直掛入裝有KRB 液的恒溫浴槽中（10 mL，37 ℃，通 95%O2、5%CO2混合氣體），一端固定，另一端連接肌張力傳感器，等長收縮模式，予1 g前負荷平衡60 min（每隔15 min更換KRB液）。記錄離體回腸自發收縮頻率，計算自發收縮的曲線下面積（area under curve,AUC）。

3.離體回腸藥理學實驗：離體腸段予1 g前負荷平衡60 min后，加入3 mol/L KCl溶液100 μL（終濃度為30 mmol/L）。洗脫藥物3次，腸段收縮穩定回歸基線后加入1 mmol/L Ach溶液100 μL（終濃度為10-5mol/L）。記錄離體回腸對KCl和Ach的最大收縮張力。

4.離體回腸電場刺激（electrical field stimulation,EFS）實驗：離體腸段予1 g前負荷平衡60 min后，將普通刺激銀電極的兩極平行置于腸段的漿肌層，待收縮穩定后，給予EFS實驗（30 V，10 Hz，1.00 ms，10 s）。記錄離體回腸對EFS的最大收縮張力。

5.數據采集和計算：自發收縮頻率和AUC取自發收縮穩定后3 min的平均值。AUC和最大收縮張力通過肌條橫截面積（cross section area,CSA）進行校正[5]：CSA（mm2）=組織濕重（mg）/[組織長度（mm）×組織密度（mg/mm3）]。 采用 Spike2 軟件進行數據分析。

四、免疫熒光實驗

SD大鼠麻醉開胸，經左心室至升主動脈插管，依次灌注0.9%NaCl溶液和4%多聚甲醛，取末端回腸約1 cm，剝離黏膜層和黏膜下層，保留漿肌層，繼續剝離環形肌，得到縱行肌腸肌間神經叢標本。以0.01 mmol/L PBS漂洗5 min×3次，加入含0.2%Triton的10%驢封閉血清30 min封閉非特異性抗原，加入Hu抗體和ChAT抗體（工作濃度分別為 1∶200 和 1∶100），4 ℃孵育過夜； 以 0.01 mmol/L PBS漂洗5 min×3次，加入二抗（工作濃度分別為1∶400 和 1∶100）， 室溫下避光孵育 1 h；0.01 mmol/L PBS漂洗5 min×3次。熒光顯微鏡下觀察，每只大鼠取 6張鋪片，每張鋪片隨機取2個視野（×200），采用Image-Impro Plus 6.0圖像分析系統計算Hu陽性神經元細胞數；計算ChAT陽性神經面積、累積光密度（IOD）值[6]。

五、統計學分析

結 果

一、大鼠離體回腸自發收縮頻率和AUC

與假手術組相比，I/R組和H2S組的自發收縮頻率無明顯差異，而后兩組之間亦無明顯差異（P>0.05）（見圖 1、表 1）。

與假手術組相比，I/R造模后離體回腸的自發收縮AUC顯著降低（P=0.00）；給予H2S干預后，離體回腸的自發收縮AUC顯著提高（P=0.01），但仍顯著低于假手術組（P=0.001）（見表 1）。

二、大鼠離體回腸對KCl和Ach的收縮反應

與假手術組相比，I/R組和H2S組離體回腸對KCl和ACh誘發的最大收縮張力均無明顯差異（P>0.05），而后兩組之間相比亦無明顯差異（P>0.05）（見圖 1、圖 2）。

三、大鼠離體回腸對EFS的反應

與假手術組相比，I/R組對EFS誘發的最大收縮張力明顯降低（P=0.00）；而給予I/R模型H2S干預后，EFS誘發的最大收縮張力顯著提高（P=0.02），與假手術組相比無明顯差異（P>0.05）（見圖 1、圖 2）。

四、Hu免疫熒光染色

免疫熒光染色示Hu抗體陽性神經元位于肌間神經叢腸神經元，神經元胞體大小不等，形態多樣，多數呈卵圓形、梭形（見圖3）。與假手術組相比，I/R組肌間神經叢腸神經元數目明顯下降（P=0.00）；給予H2S干預后，腸神經元數目顯著提高（P=0.00），但仍顯著低于假手術組（P=0.00）（見表 1）。

五、ChAT免疫熒光染色

免疫熒光染色示，ChAT抗體可使膽堿能神經元和神經纖維染色，但神經元邊界不甚清楚，辨認較為困難，而神經纖維縱橫交錯，清晰易辨別（見圖4）。與假手術組相比，I/R組興奮性膽堿能神經面積和IOD值明顯降低（P=0.00）；給予H2S干預后，這兩項指標均顯著提高（P=0.00），但仍顯著低于假手術組（P=0.00）（見表 1）。

表1 各組大鼠離體回腸自發收縮頻率和AUC、免疫熒光染色結果比較（）

表1 各組大鼠離體回腸自發收縮頻率和AUC、免疫熒光染色結果比較（）

*與假手術組比較，P<0.05；#與I/R組比較，P<0.05

ChAT抗體陽性神經IOD值正常組 6 29.00±0.63 58.61±7.79 36.55±1.21 5.18±0.30 898624.81±26265.85假手術組 6 28.67±1.21 54.10±4.89 34.33±1.64 5.23±0.40 815937.50±82704.78 I/R 組 6 29.83±1.16 28.45±2.14* 20.23±1.33* 2.42±0.20* 404990.70±45093.09*H2S 組 6 29.33±1.21 38.85±9.18*# 29.41±1.14*# 4.23±0.42*# 592828.43±120340.38*#組別 例數 自發收縮頻率（次/min）AUC（g·min/mm2）Hu抗體陽性神經元數目（個/視野）ChAT抗體陽性神經面積（×104μm2）

討 論

胃腸道動力是由 Cajal間質細胞（interstitial cells of Cajal,ICC）、平滑肌和腸神經共同調控的，腸I/R可通過引起腸神經元、平滑肌細胞、ICC的凋亡而引起小腸運動功能障礙，尤其是腸神經系統中膽堿能腸神經受損從而引起興奮性神經遞質Ach減少是最重要的原因之一。腸I/R可引起小腸自發收縮活性降低，但其對KCl、Ach收縮反應的研究結果不相一致[4,7]，且不同的I/R造模時間對其自發收縮頻率的影響亦不相同[8]。這可能與I/R造模方法不同有關。本研究采用無創動脈夾夾閉腸系膜上動脈1 h后再灌注4 h以制備腸I/R模型（I1h/R4h），其自發收縮頻率與假手術組相比無明顯改變，提示ICC起搏功能無明顯損傷；KCl誘發的最大收縮張力無明顯改變，提示平滑肌收縮功能無明顯損傷；Ach誘發的最大收縮張力無明顯改變，提示M受體及其介導的平滑肌收縮功能無明顯損傷。I/R組離體回腸自發收縮AUC以及對EFS收縮反應下降。本研究的預實驗中，離體腸段接受EFS后再給予TTX（1 μmol/L）阻斷神經傳遞，發現 EFS效應消失，證明EFS效應主要通過神經網絡傳遞擴散，其刺激誘發的最大收縮張力明顯下降提示腸神經尤其是興奮性腸神經受到明顯損傷。Hu蛋白是一組神經元特異性抗原，ChAT可催化合成Ach，可作為膽堿能神經元的標記物。進一步免疫熒光結果亦提示，I/R組肌間神經叢Hu抗體陽性神經元數目以及興奮性膽堿能ChAT陽性神經面積和IOD值較假手術組均明顯降低，表明I/R組腸神經尤其是興奮性腸神經元受到損傷。

H2S是一種第三類氣體信號分子，哺乳動物的內源性H2S主要以半胱氨酸為底物，由胱硫醚-β-合成酶（cystathionine beta-synthase,CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine gamma-lyase,CSE）代謝生成，在生理濃度下發揮多種重要的生理功能，如在神經系統中可易化海馬長時程增強，在心血管系統中可直接舒張肺、體循環血管等[9]。近來，多項研究證實缺血前給予H2S，可在多種臟器如心[10]、肺[11]、肝[12]、腎[13]的I/R模型中起保護作用。其機制可能是：H2S通過局部可逆抑制細胞色素c氧化酶而阻斷氧化磷酸化；細胞氧化還原狀態的改變誘導黃嘌呤介導的抗氧化和抗凋亡途徑，繼而使組織細胞和器官處于低代謝狀態，提高對缺血的耐受性[3,14]。上述研究結果均提示預防性給予H2S可顯著減輕I/R損傷，但在臨床上多數I/R事件是無法預知的。因此，研究缺血發生后再給予H2S是否仍具有減輕臟器損傷的作用更具有臨床意義。

本研究誘導大鼠腸缺血后，于再灌注前20 min腹腔注射2 mmol/L NaHS溶液作為干預手段，結果顯示H2S組自發收縮AUC較I/R組明顯提高，提示H2S對腸I/R后的運動功能有保護作用；同時發現，H2S組對EFS誘發的最大收縮張力較I/R組明顯提高，提示H2S可減輕興奮性腸神經的損傷。免疫熒光結果亦證實，與I/R組相比，H2S組肌間神經叢Hu陽性神經元數目以及興奮性膽堿能腸神經面積和IOD值均明顯提高，提示H2S對腸I/R后運動功能保護作用的主要機制為減輕神經元尤其是興奮性神經元的損傷。有研究[2,3]證實，腸缺血后再灌注前給予H2S可減輕I/R對腸黏膜上皮的損傷作用，其機制可能與抗氧化物酶如超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（GSH-Px）活性升高相關。閆興軍等[15]進一步證實H2S對腸I/R大鼠腸黏膜屏障功能障礙有保護作用，其部分機制是減少中性粒細胞浸潤和激活，減輕腸上皮細胞氧化損傷水平，增加SOD清除氧自由基的活性，下調活化的caspase-3和多聚ADP核糖合成酶（PARP）蛋白表達。本研究初步證實腸缺血后再灌注前給予H2S具有保護離體回腸收縮活性的作用。由此可見，H2S不僅可以預防I/R損傷，而且在損傷發生后仍具有緩解損傷的作用。

總之，本研究證實了H2S對大鼠腸I/R后離體回腸的收縮功能有保護作用，其機制主要為減輕腸神經尤其是興奮性腸神經元的損傷。然而，H2S在不同組織、不同濃度下表現出截然不同的多種生物學效應，其作為一種潛在治療藥物尚需行更廣泛和深入的研究進一步證實。

1 Collard CD, Gelman S. Pathophysiology, clinical manifestations,and prevention of ischemia-reperfusion injury[J].Anesthesiology,2001,94(6):1133-1138.

2 Liu H,Bai XB,Shi S,et al.Hydrogen sulfide protects from intestinal ischaemia-reperfusion injury in rats.J Pharm Pharmacol,2009,61(2):207-212.

3 Henderson PW,Weinstein AL,Sohn AM,et al.Hydrogen sulfide attenuates intestinal ischemia-reperfusion injury when delivered in the post-ischemic period[J].J Gastroenterol Hepatol,2010,25(10):1642-1647.

4 Ballabeni V,Barocelli E,Bertoni S,et al.Alterations of intestinal motor responsiveness in a model of mild mesenteric ischemia/reperfusion in rats[J].Life Sci,2002,71(17):2025-2035.

5 Takahashi T,Nakamura K,Itoh H,et al.Impaired expression ofnitric oxide synthase in the gastric myenteric plexus of spontaneously diabetic rats[J].Gastroenterology,1997,113(5):1535-1544.

6 Soret R,Chevalier J,De Coppet P,et al.Short-chain fatty acids regulate the enteric neurons and control gastrointestinal motility in rats[J].Gastroenterology,2010,138(5):1772-1782.

7 Ozacmak VH,Sayan H,Arslan SO,et al.Protective effect of melatonin on contractile activity and oxidative injury induced by ischemia and reperfusion of rat ileum[J].Life Sci,2005,76(14):1575-1588.

8 Shimojima N,Nakaki T,Morikawa Y,et al.Interstitial cells of Cajal in dysmotility in intestinal ischemia and reperfusion injury in rats[J].J Surg Res,2006,135(2):255-261.

9 Gadalla MM,SnyderSH.Hydrogen sulfide asa gasotransmitter[J].J Neurochem,2010,113(1):14-26.

10 Johansen D,Ytrehus K,Baxter GF.Exogenous hydrogen sulfide (H2S)protects againstregionalmyocardial ischemia-reperfusion injury--Evidence for a role of K ATP channels[J].Basic Res Cardiol,2006,101(1):53-60.

11 Fu Z,Liu X,Geng B,et al.Hydrogen sulfide protects rat lung from ischemia-reperfusion injury[J].Life Sci,2008,82(23-24):1196-1202.

12 Kang K,Zhao M,Jiang H,et al.Role of hydrogen sulfide in hepatic ischemia-reperfusion-induced injury in rats[J].Liver Transpl,2009,15(10):1306-1314.

13 Tripatara P,Patel NS,Collino M,et al.Generation of endogenous hydrogen sulfide by cystathionine gammalyase limits renal ischemia/reperfusion injury and dysfunction[J].Lab Invest,2008,88(10):1038-1048.

14 Szabó C.Hydrogen sulphide and its therapeutic potential[J].Nat Rev Drug Discov,2007,6(11):917-935.

15 閆興軍，盧根林，鄧勇.硫化氫在腸缺血-再灌注損傷大鼠腸黏膜屏障功能障礙中的作用[J].中華實驗外科雜志,2010,27(1):71-74.