腦源性神經營養因子在結腸炎后內臟高敏感小鼠中的調節作用*

楊 靜 于巖波 于 卉 左秀麗 陳哲宇 李延青#

山東省千佛山醫院消化內科1（250014） 山東大學齊魯醫院消化內科2 山東大學醫學院神經生物學研究所3

腹部不適和疼痛是炎癥性腸病（inflammatory bowel disease,IBD）和腸易激綜合征（irritable bowel syndrome,IBS）患者的臨床常見癥狀。目前認為內臟高敏感是IBD和IBS患者相關疼痛癥狀的主要病理生理機制，表現為對直腸擴張刺激的感覺閾值降低和（或）對刺激的反應強度增加[1]。IBD和IBS患者常伴有尿頻、尿急、排尿痛等膀胱高敏感并發癥，這些并發癥加重了對患者生活質量的負面影響，但發病機制尚不清楚。內臟感覺通過胞體位于背根神經節（dorsal root ganglia,DRG）的脊髓內臟傳入纖維傳遞至次級感覺神經元，進而投射至中樞神經系統[2]。DRG內關鍵分子的調控作用以及表達已成為近年內臟敏感性機制研究的熱點。

腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）是神經營養物質家族成員，在中樞和外周神經系統均有表達。近年研究發現BDNF參與調控痛覺的轉導[3]，然而系統應用BDNF基因敲除（BDNF+/-）小鼠研究BDNF在內臟敏感性中的調節作用尚未見報道。本研究以三硝基苯磺酸（TNBS）誘導建立BDNF+/-小鼠結腸炎后內臟高敏感模型，旨在探討BDNF是否參與小鼠內臟敏感性的調節。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

雜合子BDNF+/-C57BL/6小鼠38只和同窩正常野生型（BDNF+/+）C57BL/6小鼠38只由山東大學神經生物學實驗室饋贈。從鼠尾組織標本中提取DNA通過聚合酶鏈反應（PCR）行基因分型。小鼠于（21±1）℃溫度、50%±5%空氣濕度、避強光的環境中喂養，自由飲水、攝食。

TNBS、苯巴比妥鈉（Sigma 公司），ELISA BDNF試劑盒（Promega公司）。BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），乙醇、多聚甲醛等購自天津市大茂化學試劑廠。

二、動物分組和模型建立

所有小鼠分為BDNF+/+對照組、BDNF+/+TNBS炎癥組、BDNF+/-對照組和BDNF+/-TNBS炎癥組，每組各19只。按照Engel等[4]的方法制備結腸炎后內臟高敏感小鼠模型。1.75 mg TNBS溶解于50%的乙醇中，終體積為0.1 mL。以注射器吸取配置好的TNBS，然后與一內徑為1.2 mm的聚乙烯塑料管相連，導管末端用石蠟油充分潤滑以避免操作對結腸黏膜的物理性損傷。小鼠灌腸前24 h禁食不禁水，乙醚吸入麻醉后，將導管緩慢插入降結腸直至導管末端距小鼠肛門約4 cm處，將TNBS緩緩推入降結腸。為避免TNBS外漏，保持小鼠倒立約30 s。對照組給予同等劑量的50%乙醇。

三、結腸和膀胱組織學檢查

造模7 d后，每組隨機取7只小鼠腹腔注射過量苯巴比妥鈉（200 mg/kg）處死，取遠端3 cm的降結腸和膀胱，于4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，冠狀連續切片，片厚5 μm，行HE染色。由對實驗設計和操作全盲的病理醫師行結腸組織學半定量評分[5]：0 分，正常無炎癥；1 分，低度炎癥；2 分，中等炎性粒細胞浸潤；3分，高度炎性粒細胞浸潤，高度血管密度，腸壁增厚；4分，透壁炎癥，杯狀細胞缺失，高度血管密度，腸壁增厚。膀胱組織病理學半定量評分[6]：0分，正常無炎癥；1分，低度炎癥，無或低度水腫；2分，中度炎性浸潤和水腫；3分，重度炎性浸潤和水腫。

四、ELISA測定DRG內BDNF表達

上述行組織學檢查的小鼠同時快速取支配結腸的脊髓胸腰部 T10-L1（TL）和腰骶部 L6-S1（LS）DRG，加入蛋白裂解緩沖液裂解30 min，行BCA蛋白定量。嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測BDNF蛋白表達。

五、內臟敏感性

造模7 d后，每組選取6只小鼠行結直腸擴張（colorectal distension,CRD）并記錄腹壁回撤反射（abdominal withdrawal reflex,AWR）評分[7]。 乙醚輕度麻醉小鼠后，將緊密連接于聚四氟乙烯導管上特制的 2 cm聚乙烯塑料球囊輕輕插入降結腸，球囊近端距肛門約0.5 cm，導管用膠布固定于鼠尾。導管另一端緊密連接水銀血壓計。待小鼠充分蘇醒并適應后，分別在 0、15、30、45、60 和 80 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）壓力下行結腸球囊擴張。每次擴張持續20 s，間隔4 min。由對實驗設計全盲的觀察者記錄不同壓力下AWR評分，所有測量均重復3次。AWR評分系統：0分：對球囊擴張無反應；1分：身體靜止不動或頭部運動減少；2分：腹部肌肉收縮；3分：腹部抬高；4分：骨盆抬起，身體呈弓形。

六、膀胱敏感性

造模7 d后，每組選取6只小鼠以1.2 g/kg氨基甲酸酯腹腔注射麻醉，中下腹部逐層剖開，暴露出膀胱，在膀胱頂部制一小切口，緩緩插入PE50導管，以氨基丙烯酸酯黏膠固定，15 min后膀胱排空。導管另一端通過三通管連接至灌流泵和壓力換能器上。2 min后，0.9%NaCl溶液以20 μL/min的速度持續灌流2 h，建立穩定而可重復排尿的膀胱內壓測量系統。記錄三次排尿間隔時間[8]，取均值。

七、統計學分析

結 果

一、結腸和膀胱組織學檢查

對于兩種不同基因型的小鼠，TNBS均可誘導明顯的結腸炎癥，組織學檢查表現為節段性潰瘍形成，腸黏膜中度充血水腫，大量炎性粒細胞浸潤和部分上皮壞死脫落（見圖1）。BDNF+/+TNBS炎癥組結腸組織學評分顯著高于BDNF+/+對照組（P<0.01），BDNF+/-TNBS炎癥組評分亦顯著高于BDNF+/-對照組（P<0.01），而兩個炎癥組之間相比無明顯差異（見表 1）。

各組小鼠膀胱組織學切片均顯示結構正常完整，無炎癥指征（見圖2），組織學評分均為0。

二、DRG內BDNF蛋白表達

非炎癥狀態下，BDNF+/-小鼠支配結腸的TL和LS DRG內BDNF蛋白表達均約為BDNF+/+小鼠的一半，組間相比差異有統計學意義（P<0.05）。兩種不同基因型的TNBS炎癥組TL和LS DRG內BDNF蛋白表達均顯著高于相應對照組（P<0.01）。BDNF+/-TNBS炎癥組TL和LS DRG內BDNF蛋白表達顯著低于 BDNF+/+TNBS 炎癥組（P<0.001）（見表 1）。

三、不同擴張壓力下小鼠AWR評分

非炎癥狀態下，擴張壓力<60 mm Hg時，BDNF+/-小鼠AWR評分與BDNF+/+小鼠相比無明顯差異；而擴張壓力為60、80 mm Hg時，BDNF+/+小鼠AWR評分顯著高于BDNF+/-小鼠（P<0.05）。在BDNF+/+小鼠中，擴張壓力≥30 mm Hg時，TNBS炎癥組AWR評分顯著高于對照組（P<0.01）；擴張壓力<30 mm Hg時兩組無明顯差異。在BDNF+/-小鼠中，擴張壓力≥45 mm Hg時，TNBS炎癥組AWR評分顯著高于對照組（P<0.01）；擴張壓力<45 mm Hg時兩組無明顯差異。擴張壓力≥30 mm Hg時，BDNF+/-TNBS炎癥組AWR評分顯著低于BDNF+/+TNBS 炎癥組（P<0.05）（見表 1、圖 3）。

表1 各組小鼠結腸組織學評分、BDNF蛋白表達、AWR評分和排尿間隔比較（）

表1 各組小鼠結腸組織學評分、BDNF蛋白表達、AWR評分和排尿間隔比較（）

與同基因型對照組比較，*P<0.01，**P<0.001；與 BDNF+/+TNBS 炎癥組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；△與 BDNF+/+對照組比較，P<0.05

四、膀胱敏感性

非炎癥狀態下，BDNF+/-小鼠與BDNF+/+小鼠的排尿間隔相比無明顯差異。兩種不同基因型TNBS炎癥組排尿間隔均顯著短于相應對照組（P<0.001）。BDNF+/-TNBS炎癥組排尿間隔顯著高于BDNF+/+TNBS 炎癥組（P<0.01）（見表 1）。

討 論

根據解剖學分布特點，支配結腸DRG的神經元纖維主要分為兩類：一類為內臟神經，神經元胞體位于脊髓胸腰段T10-L1；另一類為盆神經，胞體位于脊髓腰骶段L6-S1[9]。這些神經纖維裸露的末梢分布于腸壁各層，分別沿著交感神經和副交感神經走行，穿過椎旁節和椎前節，到達脊髓后角。內臟敏感性的變化主要由外周和中樞機制引起[2]。各種原因引起的感覺神經末梢和初級傳入神經元的致敏均可誘導中樞敏感化，探索DRG內參與結腸炎后致敏的關鍵分子對明確結腸高敏感的發生機制有重要意義。

BDNF廣泛分布于中樞和周圍神經系統，可維持胚胎期神經元的存活、分化，并參與調節成熟神經元的功能。既往研究認為，BDNF可調控突觸可塑性，并參與學習、記憶等多項功能[10]。有研究發現BDNF亦參與痛覺的轉導與調控[3]。在外周炎癥誘導的疼痛模型中，DRG內BDNF表達明顯上調。研究發現，鞘內注射BDNF抗體能抑制后足切割疼痛模型的痛覺過敏，表明BDNF參與神經源性軀體疼痛[11]。臨床研究[12]亦發現慢性胰腺炎患者的胰腺組織內BDNF表達明顯上調，并與胰腺炎性疼痛的發生密切相關。本研究中，非炎癥狀態下，BDNF+/-小鼠DRG內BDNF蛋白表達明顯低于BDNF+/+小鼠，但兩種基因型小鼠間結腸敏感性無明顯差異。僅球囊擴張壓力≥60 mm Hg時，相較于BDNF+/+小鼠，BDNF+/-小鼠表現為結腸低反應性。

本研究發現，對于BDNF+/-和BDNF+/+小鼠，TNBS均有顯著的炎性致敏作用。TNBS模型是研究腸道傳入神經外周致敏化機制的重要手段。大量研究發現TNBS誘導結腸炎后，局部可釋放炎性介質如P物質、緩激肽、前列腺素E2、降鈣素基因相關肽等[13～15]。分布于消化道壁的初級傳入纖維末梢受到這些炎性介質的刺激活化，將感覺信號放大傳遞至中樞神經系統[16]。BDNF可能與上述炎性介質共同協作參與炎性內臟高敏感的調控。本研究結果證實，TNBS誘導炎癥后兩種不同基因型小鼠DRG內BDNF表達均增加，同時伴有結腸高敏感。結腸炎后BDNF+/-小鼠BDNF表達明顯低于BDNF+/+小鼠，同時結腸敏感性亦低于BDNF+/+小鼠。提示BDNF參與結腸炎后的內臟致敏。而在非炎癥狀態下，低壓力 CRD時，BDNF+/+和 BDNF+/-小鼠之間AWR評分無明顯差異，這可能源自于BDNF的生物學特性。BDNF在DRG中主要分布于中小直徑的神經元，而中小直徑神經元發出Aδ和C類纖維，傳遞傷害性感覺，為高閾值感受器[17]，因此非炎癥狀態時BDNF部分敲除對于較低壓力的非傷害性結腸刺激無明顯抑制作用，可能由BDNF高閾值感受器的特性所致。

臨床上IBD和IBS患者除反復發作的腹痛、腹瀉等消化道癥狀外，常伴有尿頻、尿急、尿痛等膀胱高反應性的并發癥。目前觀點認為這種腹腔臟器的癥狀重疊可能來自于支配不同臟器的神經在DRG水平的 “集合”（convergence）[18]。應用逆行熒光示蹤技術，標記小鼠DRG內來自膀胱和結腸的神經元，證實兩者在 TL DRG（T13-L1）和 LS DRG（L5-S1）內存在一定比例的重合[19]。作為感覺信息轉導的“門控”，研究參與DRG水平神經元“集合”的關鍵分子對揭示牽涉性膀胱高敏感具有重要意義。

Qin等[20]的研究發現，大鼠結腸炎模型膀胱壁無組織病理學改變。本研究中，以TNBS建立小鼠結腸炎模型，亦發現膀胱無炎癥表現，組織結構正常完整；BDNF+/-炎癥小鼠的膀胱敏感性顯著低于BDNF+/+炎癥小鼠，而在非炎癥狀態下，BDNF部分敲除對膀胱敏感性無明顯影響。提示BDNF可能在DRG水平參與牽涉性膀胱高敏感的發生，其作用趨向于調控者而非始發因子，且調控作用可能亦需在結腸炎癥狀態下由多種炎性介質的刺激和協同作用而實現。

綜上所述，本研究通過應用BDNF基因敲除小鼠，證實BDNF參與結腸炎后結腸高敏感和牽涉性膀胱高敏感的發生，為研制針對腹痛癥狀的藥物提供了一定的理論依據。

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