唑來膦酸注射劑細菌內毒素檢查的研究

高 峰 石 峰 魏國義

1.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院，北京 100029；2.保諾科技（北京）有限公司，北京 102206

唑來膦酸是美國FDA批準的第3代雙膦酸鹽類藥物，在臨床上用于惡性腫瘤溶骨性骨轉移引起的骨痛、惡性腫瘤引起的高鈣血癥以及老年原發(fā)性骨質疏松等骨吸收增加類疾病。目前國產的唑來膦酸注射劑主要有注射用粉針和注射液，且有多個廠家生產，國家食品藥品監(jiān)督管理局標準，進口藥品注冊標準等多個執(zhí)行標準共存，其熱原檢查方法有家兔法和細菌內毒素法，不同標準的檢查限度存在差異。為統(tǒng)一該品種的細菌內毒素檢查標準，筆者按照《中國藥典》2010年版附錄中細菌內毒素檢查法[1-2]，對唑來膦酸注射劑進行提高限度菌內毒素檢查，以統(tǒng)一其標準，結果報道如下：

1 儀器與試藥

TW12六孔恒溫水浴 （產自Julabo公司）；MSI旋渦混合器（購自廣州IKA公司）。

細菌內毒素工作標準品 （規(guī)格：每支120 EU，批號：150601-200699）購自中國藥品生物制品檢定所；細菌內毒素檢查用水（規(guī)格：50 mL/支，批號：1105060）及鱟試劑（TAL）A（規(guī)格：0.1 mL/支，批號：1101202，靈敏度：0.25 EU/mL）購自湛江安度斯生物有限公司；TAL B（規(guī)格：0.1 mL/支，批號：110603，靈敏度：0.25 EU/mL）購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司；注射用唑來膦酸分別產自深圳海王有限公司，批號：20100502，吉林西點藥業(yè)有限公司，批號：20100121，南京制藥廠有限公司，批號：20101101；唑來膦酸注射液分別產自江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司，批號：1005281，成都天臺山制藥有限公司，批號100601。

2 方法與結果

2.1 細菌內毒素限值的確定

根據限度最高的標準，注射用唑來膦酸細菌內毒素限值定為5.0 EU/g；唑來膦酸注射液細菌內毒素限值定為3.5 EU/mL。

2.2 鱟試劑靈敏度的復核

鱟試劑標示靈敏度（λ）的復核按照《中國藥典》2010年版二部附錄細菌內毒素檢查法的要求進行試驗。檢驗結果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核試驗結果

由表1可見，三批鱟試劑λC均在0.5λ～2.0λ之間，符合細菌內毒素檢查的規(guī)定。

2.3 干擾預試驗[3-7]

2.3.1 根據公式，最小有效稀釋濃度C=λ/L，L值一般取5.0 EU/mg，目前市售鱟試劑靈敏度（λ）在 0.25～0.03 EU/mL之間，故注射用唑來膦酸進行細菌內毒素檢測時的不同靈敏度鱟試劑所對應的最大有效稀釋濃度分別為0.050 00、0.025 00、0.012 50、0.006 25 mg/mL。唑來膦酸注射液的限度L=3.5 EU/mL，故唑來膦酸注射液進行細菌內毒素檢查的鱟試劑所對應的最小有效稀釋倍數分別為 14、28、56、112。

2.3.2 預試驗操作為取三批注射用唑來膦酸，用BET檢查用水將樣品稀釋成 0.050 00、0.025 00、0.012 50、0.006 25 mg/mL共4個濃度梯度的溶液，將此系列濃度溶液標記為供試品管（NPC系列）。取兩批唑來膦酸注射液，用BET檢查用水分別將樣品稀釋14、28、56、112倍，以上述稀釋液作為溶劑，溶解并稀釋細菌內毒素工作標準品，制得每個稀釋度中細菌內毒素含量均為2λ（0.5 EU/mL）的唑來膦酸溶液，標記此系列溶液為供試品陽性對照管（PPC系列）。取靈敏度為0.25 EU/mL的兩個不同廠家的鱟試劑進行試驗，每一稀釋度做兩管，同時按常規(guī)分別設細菌內毒素陽性對照（PC）和檢查用水陰性對照（NC）各兩管，結果見表2。

表2 樣品干擾預試驗結果

從表2可見，所用的三批注射用唑來膦酸的最大無干擾濃度不低于0.050 00 mg/mL，兩批唑來膦酸注射液最小無干擾稀釋倍數不高于14倍，在此條件下，受試樣品對兩個廠家的鱟試劑與細菌內毒素反應均無干擾作用。

2.4 正式干擾試驗

用兩個廠家的鱟試劑（靈敏度為0.25 EU/mL），按《中國藥典》2010年版方法進行試驗，測定用BET水制成的內毒素標準溶液的反應終點濃度的幾何平均值（Es）和用供試品稀釋液制成的內毒素溶液的反應終點濃度的幾何平均值（Et）。取三批注射用唑來膦酸，分別加BET檢查用水稀釋成0.05mg/mL，兩批唑來膦酸注射液分別加BET檢查用水稀釋14倍，再用BET水和供試品稀釋液將細菌內毒素工作標準品稀釋成 2.00λ、1.00λ、0.50λ、0.25λ 濃度的 BET 水系列細菌內毒素溶液和供試品稀釋液系列細菌內毒素溶液，每一稀釋濃度重復4管，同時用上述供試品稀釋液和BET水各做兩管陰性對照管，按下列公式計算BET水和供試品稀釋液反應終點濃度的幾何平均值（Es 和 Et），Es=lg-1（∑Xs/4），Et=lg-1（∑Xt/4）。 見表 3。

表3 樣品干擾試驗結果

從表 3 結果可見，2.00λ 管均為陽性，0.50λ、0.25λ 管均為陰性，對于λ=0.25 EU/mL的兩組鱟試劑的Es為0.25 EU/mL，Es均在0.50λ～2.00λ范圍內，各批唑來膦酸制劑測得的Et均在 0.50λ～2.00λ 范圍內，Et和 Es的比值在 0.5～2.0 之間，說明唑來膦酸制劑在該實驗條件下對兩個不同廠家的鱟試劑與內毒素的反應無干擾作用。

2.5 樣品細菌內毒素檢查

取三批注射用唑來膦酸和兩批唑來膦酸注射液，分別根據"2.4"項下方法制成供試品稀釋液，使用兩個廠家的鱟試劑按現行《中國藥典》2010年版細菌內毒素檢查法進行細菌內毒素檢查，結果見表4、5。各批唑來膦酸注射劑的細菌內毒素檢查均符合規(guī)定。

3 討論

細菌內毒素檢查法是目前應用最為廣泛的熱原檢查法的體外替代檢測方法，但該方法存在易受到各種檢測因素干擾的缺點，故統(tǒng)一其市面上流通的同一品種的限度標準，對提高其用藥標準，改善其制劑工藝有著重要意義。本研究采用兩個不同廠家不同靈敏度的鱟試劑對各個不同廠家生產的唑來膦酸注射劑進行試驗，認為同樣的細菌內毒素限度標準對它們進行質量控制是可行的，對于提高其注射用制劑的水平奠定了基礎[7-8]。

表4 樣品細菌內毒素檢查結果1

表5 樣品細菌內毒素檢查結果2

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