電針與鋅合用對帕金森病模型大鼠一氧化氮、丙二醛等的影響

石 波 楊 蓉 田維珍 劉海霞 孔德祥 劉長金

1.湖北中醫藥高等專科學校，湖北荊州 434020；2.華中科技大學同濟醫學院生理系，湖北武漢 430030

帕金森病（PD）是一種中老年常見的持續加重的中樞神經系統退行性疾病，其病理改變是中腦黑質-紋狀體通路中多巴胺（DA）的缺失，臨床表現以肌強直、肢體震顫、運動減少和姿勢反射障礙等癥狀為主要特征。盡管PD的病因仍不十分清楚，但氧化應激過度與自由基毒性對該病的形成無疑起了重要作用。據報道，電針在治療PD模型大鼠和PD患者時均表現出抗氧化作用[1-3]，為治療PD的安全、有效、經濟的輔助方法[4]。鋅是一種副作用小、價格便宜的微量元素，是機體重要的營養素，鋅本身也是一種抗氧化物質[5]。現己證明鋅參與體內300余種酶和功能蛋白的組成。另外，鋅還是許多功能蛋白如金屬硫蛋白、核蛋白、受體等的組成成分[6]，鋅具有廣泛的生理和生化功能。因此，筆者通過電針與小劑量鋅合用，試圖了解它們對PD模型大鼠置質超氧化物岐化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）的影響，探討它們治療帕金森病的抗氧化協同作用和潛在機制以及一種價廉、安全、有效的新型治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

取體重200～250 g成年SD大鼠100只，雌雄各半，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供（合格證：醫動字第00018516號）。

1.2 儀器、主要藥物與試劑

腦立體定位儀、疲勞轉棒儀、HANS LY257恒流電針儀、臺式高速冷凍離心機、執筆式牙科鉆（上海江灣醫療器械廠），XHF-1高速分散器十萬分之一電子天平 （上海金達生化儀器廠），日立850 model熒光分光光度計（日本日立公司產），-70℃超低溫冰箱，溫箱及烤箱，光學顯微鏡（日本島津）；6-羥基多巴胺（6-OHDA，美國Sigma公司）、戊巴比妥鈉、阿樸嗎啡溶液 （5 mg/2 mL/kg體重），PBS試劑，DAB，TH抗體，ABC試劑盒，MDA、SOD、NO試劑盒，二甲苯，樹脂，硫酸鋅等均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模方法與分組

100只大鼠隨機分為假手術對照組（假手術組或Sham組，每組10只）和模型組（9只）。造模方法：將擬造模大鼠以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后，常規備皮消毒，切開皮膚，將大鼠顱腹臥位居中固定于大鼠腦立體定位儀上。根據包新民等[7]著大鼠腦立體定向圖譜確定右側黑質定位坐標為：前囟后3.5 mm，矢狀線右側旁開2.5 mm，硬膜下深7.5 mm。標記點坐標，用執筆式牙科鉆鉆透顱骨，牙科探針穿透硬膜。用微量注射器將 4 μL（4 μg/μL）6-OHDA（溶于含 0.2%抗壞血酸的生理鹽水中）注入上述位點各2 μL，緩慢進針，注射速度0.5 μL/min，注射完畢留針10 min后，以1 mm/min的速度退針，明膠海綿填塞顱骨孔，顱骨表面局部灑少量青霉素粉劑，縫合皮膚，碘酒擦拭縫合處。假手術組立體定位下注射等量生理鹽水（內含0.2%維生素C）。術后抗炎3 d。術后2周，給造模大鼠腹腔注射APO（0.5 mg/kg），誘導旋轉行為，以每分鐘旋轉不低于7次者為成功模型。造模前后死亡和不合格31只。除①Sham組外，共將合格模型大鼠59只再次隨機分為②模型組（MFB組）、③只扎針不通電組（0 Hz組）、④120 Hz電針治療組 （120 Hz組）、⑤120 Hz+鋅組和⑥鋅組。除了MFB組9只，其余每組均為10只。

1.3.2 治療方法

動物在同等條件下（室溫20℃，相對濕度45%）普通飼養。參照華興邦[8]制訂的實驗動物穴位圖譜，120 Hz組、120 Hz+鋅組取百會、命門穴，用13 mm的毫針針刺，接HANSLY 257恒流電針儀，采用連續波，頻率為120 Hz，刺激強度以大鼠腿部輕微抽動為度（2～6 mA）。每次30 min，每天1次，2周為1個療程，療程間休息1 d，共治療3個療程。120 Hz+鋅組和鋅組的飼料中含小劑量硫酸鋅[9]（120 mg鋅/kg飼糧，即在基礎飼料[9]（經原子吸收光度計檢測，含鋅量為20.0 mg/kg）的基礎上以硫酸鋅的形式（100 mg鋅/kg飼糧）添加鋅到飼料中，每只大鼠每天的飼糧量按25 g供給。飼糧一次性配好。Sham組和MFB組不給予治療。

1.3.3 檢測指標及方法

1.3.3.1 各組大鼠行為學檢測 轉棒試驗：治療觀察2周后，每隔1周，進行行為學觀察。將大鼠放在轉棒上，啟動轉棒，開始計時（由計算機完成），大鼠為保持平衡而跟隨轉棒運動，逐漸增加轉棒轉速，觀察大鼠運動，直至大鼠從轉棒上掉落，結束計時。從計時開始，到大鼠落地計時結束的時間愈長，大鼠行為學的改善愈好。

1.3.3.2 各組大鼠右側黑質丙二醛、一氧化氮含量和超氧化物歧化酶活性測定 最后1次行為檢測后迅速處死動物，斷頭取腦，置于冰盤上分離右側黑質，置于-70℃冰箱保存備用。取一半黑質采用手工勻漿法制成100 g/L組織勻漿，MDA、NO含量和SOD活性的測定均按北京中杉金橋試劑盒說明書步驟，用分光光度計檢測；另一半用10%的多聚甲醛固定，進行黑質形態學觀察。

1.3.3.3 取材、切片，光鏡觀察黑質TH陽性細胞形態學變化用10%的多聚甲醛固定黑質，石蠟切片，常規脫蠟至水后，TH免疫組化染色步驟按北京中杉金橋ABC試劑盒的說明進行。在光鏡下觀察黑質TH陽性細胞的形態和數量并拍片。結果判定：經染色后TH陽性細胞胞漿為棕褐色。

1.4 統計學方法

所有數據應用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料采用百分率表示，組間對比采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學測試

MFB組和0 Hz組與Sham組相比大鼠的運動平衡能力明顯減弱（P＜0.05），說明6-OHDA對MFB組和0 Hz組的大鼠黑質造成損害從而影響行為學；120 Hz組、鋅組和120 Hz+鋅組與MFB組相比，在棒上停留時間均明顯延長（P＜0.05和P＜0.01），說明一定頻率的電針與鋅均對行為學有改善作用，而120 Hz+鋅組在前4周對行為學的改善比120 Hz組、鋅組效果更顯著。說明電針與小劑量鋅合用在明顯增強PD模型大鼠的運動平衡能力方面有協同作用。見表1。

2.2 各實驗組大鼠黑質超氧化物歧化酶活性、一氧化氮和丙二醛含量測定結果

模型組大鼠黑質SOD活性、NO和MDA含量與Sham組比較差異有非常顯著性意義（P＜0.01）。120 Hz+鋅組的以上指標與模型組相比具有顯著性意義（P＜0.01）；120 Hz+鋅組與120 Hz組以及鋅組相比，以上指標也有統計學意義（P＜0.05）。說明電針和小劑量鋅對帕金森病患者體內抗氧化酶系統具有調整作用和協同調整作用。見表2。

2.3 光鏡下各實驗組大鼠右側黑質細胞形態學變化

MFB組和0 Hz組與Sham組比較，黑質TH陽性神經元明顯減少，細胞結構不清，核固縮 ，細胞內出現多個空泡呈現細胞早期凋亡的特征；120 Hz組、鋅組和120 Hz+鋅組與MFB組相比，黑質TH陽性神經元形態學明顯改善，細胞數量明顯增加，但與Sham組仍有一定的差距，其中120 Hz+鋅組的黑質TH陽性神經元形態學改善比MFB組和0 Hz組更加明顯（圖1～6在湖北省荊州市中心醫院病理科完成）。見圖1～6。

表1 各組大鼠第1～6周轉棒試驗數據（±s，s）

表1 各組大鼠第1～6周轉棒試驗數據（±s，s）

注：與 MFB 組比較，●P ＜ 0.05，●●P ＜ 0.01；與 Sham 組比較，▲P ＜ 0.05

組別 鼠數 第1周末 第2周末 第3周末 第4周末 第5周末 第6周末①Sham組②MFB組③0 Hz組④120 Hz組⑤120 Hz+鋅組⑥鋅組10 9 10 10 10 10 128±7 97±5▲109±9 123±9●141±8●●121±10●146±9 107±9▲115±7▲136±11●155±10●●134±8●152±8 113±7▲119±8▲145±7●163±11●●143±11●156±9 118±8▲126±10▲153±11●169±9●●151±7●161±7 123±6▲129±7▲157±10●170±8●155±10●164±6 125±7▲133±6▲159±8●172±10●158±9●

表2 各組大鼠黑質超氧化物歧化酶活性、一氧化氮和丙二醛含量的比較（±s）

表2 各組大鼠黑質超氧化物歧化酶活性、一氧化氮和丙二醛含量的比較（±s）

注：與 Sham 組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01；與 MFB 組比較，●P ＜ 0.05，●●P＜ 0.01；與 120 Hz組比較，★P ＜ 0.05

組別 鼠數 SOD（U/mL） NO（mol/L） MDA（mol/mg）①Sham組②MFB組③0 Hz組④120 Hz⑤120 Hz+鋅組⑥鋅組10 9 10 10 10 10 64.4±14.2 48.7±12.6▲49.6±13.4 62.8±11.6●76.0±15.7●●★61.6±12.7●65.5±13.6 33.4±6.8▲▲34.2±15.3 50.3±14.2●●57.3±13.0●●43.0±16.1●4.6±2.7 7.8±4.1▲▲7.4±3.0 4.8±3.1●●3.7±2.9●●★5.2±2.8●●

3 討論

帕金森病是一種老年病，隨著年齡的增高，MDA的含量增加、SOD活性下降，體內清除自由基的防御功能日趨衰退，導致自由基增多，過多的自由基可使神經細胞老化和數量大量減少而導致PD的發病[2-3]。本實驗造模后，帕金森病大鼠因缺血缺氧，引起細胞膜及細胞器膜發生脂質過氧化，釋放大量的自由基，消耗大量的NO，導致SOD活性降低，產生大量的MDA。與模型組比，120 Hz組、鋅組以及120 Hz+鋅組治療后，SOD活性明顯增強，NO顯著增加，MDA明顯減少。120 Hz+鋅組與120 Hz組、鋅組比較，抗氧化作用明顯增強（P＜0.05）。SOD能清除多巴胺經氧化代謝產生的H2O2，使多巴胺神經元免受氧化損傷，對機體預防和阻礙PD的發生和發展起到積極的神經保護和治療作用[2-3]。腦和神經原產生的NO可能參與了中樞神經系統的信息傳遞，起細胞間信使作用和神經遞質作用。腦內NO具有松弛平滑肌、擴張血管、抑制血小板聚集及減輕細胞毒的作用[2，10]。本實驗中，120 Hz組、鋅組、以及120 Hz+鋅組經治療均能明顯改善PD動物的行為，尤以120 Hz+鋅組更為明顯。電針對PD大鼠黑質細胞通過增加抗氧化酶系統的作用，調動機體自身的各種內在保護機制[2-3，11]。抗氧化微量元素鋅參與抗氧化酶的重要構成，同時本身也具有抗氧化功能。鋅具有穩定超氧化物歧化酶的結構，鋅可與過渡金屬離子（Fe2＋等）競爭，使H2O2不能轉化為毒性更強的羥自由基，減少過氧化脂質（LPO）的生成，增加機體消除自由基的能力，保護生物膜[12]。鋅還可通過保護巰基抗氧化和抑制活性氧產生而發揮抗氧化作用[5]。由本實驗結果可知，電針以及飼料中加鋅后，機體抗氧化酶活性顯著增強，且電針與小劑量鋅聯合應用比各自單獨用的效果更好，說明鋅在一定程度上可加強電針的抗氧化作用。同時電針和鋅均可調節腦內遞質，使黑質紋狀體內興奮性和抑制性的兩種遞質處于平衡狀態，從而維持正常運動機能，改善行為學[13-15]。120 Hz+鋅組黑質神經元的數量和形態與模型組比有顯著改善，大量的壞死細胞和萎縮神經元得到修復，與電針和鋅的抗氧化作用密切相關。

綜上所述，電針與小劑量鋅合用對PD大鼠在增強SOD活性、增加NO和減少MDA含量以及保護黑質多巴胺神經元方面均具有協同效應。電針與小劑量鋅合用對PD大鼠的治療作用與它們調整體內抗氧化酶系統有關。但本研究中與電針合用的鋅劑量是否是最佳劑量，多少劑量的鋅與電針合用對PD的防治既安全又能發揮最好的效果以及它們的治療時間和作用機制還有待深入研究。

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