CD4＋CD25＋、CD4＋CD25hig調節性T細胞和Foxp3mRNA在嬰幼兒喘息中的表達及意義

彭 力，鐘禮立，黃 寒，厲 娟，梁 沫，李 云

（湖南省人民醫院兒科，長沙410005）

嬰幼兒喘息是小兒呼吸道疾病的一種常見癥狀，有反復發作傾向，其中30%～50%患兒可發展成哮喘。而判斷哪些嬰幼兒喘息最終會發展為哮喘，需要早期干預治療仍然是目前喘息性疾病防治的一個難點。CD4＋CD25＋調節性T細胞（regulatory T cells，Treg），具有低反應性和免疫抑制兩大功能特性，但具有免疫調節或抑制活性的細胞主要是高表達CD25＋的CD4＋T細胞（CD4＋CD25higTreg）。人轉錄因子Foxp3是Treg分化發育的關鍵基因，主要表達于CD4＋CD25higTreg。Treg在兒童支氣管哮喘和過敏性疾病的發病中表達是下調的，但在嬰幼兒喘息中的表達研究甚少。本研究試圖通過對首次喘息嬰幼兒CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg及叉頭／翼狀螺旋轉錄因子（Foxp3）mRNA表達的研究，探討有特應征和非特應征喘息嬰幼兒CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg及Foxp3mRNA表達變化及與IgE的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2010年10月至2011年1月因喘息性疾病住院的嬰幼兒（首次發作）55例，兩肺聽診有喘鳴音，其中4例（后來經胸部CT、纖維支氣管鏡檢查有支氣管軟化2例、呼吸道異物2例）除外，共51例患兒，其中男36例，女15例；年齡1個月至3歲（中位年齡8個月）。其中特應征組28例，男22例，女6例；有濕疹、過敏性鼻炎等特應征及特應征家族史。非特應征喘息組23例，男14例，女9例；無濕疹、過敏性鼻炎等特應征及特應征家族史。對照組20例，為門診健康體檢者，無家族過敏史及近期無呼吸道感染嬰幼兒。采血前2周均未用過糖皮質激素、抗組胺藥及免疫調節劑。

1.2 方法

1.2.1 CD4＋CD25＋Treg和CD4＋CD25higTreg測定 CD4＋CD25＋Treg和CD4＋CD25higTreg的測定分別采集喘息嬰幼兒及健康患兒外周靜脈血2mL，肝素抗凝；取肝素抗凝的全血100μL，加入CD4－PE和 CD25－FITC單克隆抗體20μL，IgG1－PE和IgG1－FITC作為同型對照，室溫閉光反應30min；加2mL溶血劑在室溫下溶解紅細胞約10min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，離心 5min（1 500r／min），棄上清；每份標本加入1%多聚甲醛500μL后用流式細胞儀檢測。流式細胞儀為Beckman－CoulterXL100（Coulter公司產品）。

1.2.2 RT－PCR檢測 PBMCsFoxp3mRNA 的表達 分離外周血中單個核淋巴細胞，用PBS洗滌2次，加入Trizol提取細胞總RNA，經紫外線分光光度法定量后，取5μgRNA在寡聚脫氧胸苷酸（oligo－dT）和Moloney鼠白血病病毒逆轉錄酶（MMLV）存在的情況下進行逆轉錄反應合成互補DNA（cDNA），以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列為：Foxp3（176bp）正義5′－CAG CAC ATT CCC AGA GTT CCT C－3′，反義5′－GCG TGT GAA CCA GTG GTA GAT C－3′，內參基因三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）（598bp）正義5′－CCA CCC ATG GCA AAT I′CC ATG GCA－3′，反義5′－TCT AGA CGG CAG GTC AGG TCC ACC－3′。反應條件：94℃預變性5min，94℃變性1min，60℃退火2min，72℃延伸2min，32個循環后PCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳。電泳圖像用英國UVP公司GDS8000型全自動圖像分析系統處理，以同一標本的Foxp3與內參照GAPDH擴增條帶的光密度比值。

1.2.3 血清總IgE水平測定 取另外2mL外周血，取血清用瑞典瑪西亞公司UniCAP變應原檢測系統酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血清總IgE水平。

2 結 果

2.1 喘息組和對照組 CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg百分率及Foxp3mRNA比較 喘息患者外周血CD4＋CD25＋Treg和CD4＋CD25higTreg細胞占CD4＋T細胞的百分比及Foxp3mRNA均明顯低于健康對照組。性別、年齡與CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg及Foxp3mRNA表達不相關。見表1和圖1。

表1 喘息組和對照組CD4＋CD25＋、CD4＋CD25hig Treg百分率及Foxp3mRNA比較（±s）

表1 喘息組和對照組CD4＋CD25＋、CD4＋CD25hig Treg百分率及Foxp3mRNA比較（±s）

＊：P＜0.01，與對照組比較。

組別 nCD4＋CD25＋Treg（%）CD4＋CD25higTreg（%）Foxp3m RNA／GAPDH喘息組 51 6.31＋2.96＊ 3.52＋1.46＊ 0.27＋0.11＊對照組20 9.28＋2.40 4.81＋1.50 0.39＋0.19

表2 兩組CD4＋CD25＋、CD4＋CD25higTreg百分率及Foxp3mRNA與總IgE比較（±s）

表2 兩組CD4＋CD25＋、CD4＋CD25higTreg百分率及Foxp3mRNA與總IgE比較（±s）

＊：P＜0.05，＊＊：P＜0.01，與非特應征喘息組比較。

組別 n CD4＋CD25＋Treg（%） CD4＋CD25higTreg（%） Foxp3mRNA／GAPDH 總IgE特應征喘息組 28 4.66＋1.17＊ 2.50＋0.52＊ 0.24＋0.13＊ 102.00＋47.43＊＊非特應征喘息組 23 7.96＋3.33 4.56＋2.01 0.30＋0.08 26.85＋15.30

圖1 喘息嬰幼兒外周血Treg Foxp3mRNA和參比基因電泳圖

2.2 特應征喘息與非特應征喘息嬰幼兒CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg百分率及Foxp3mRNA、IgE比較 特應征喘息組外周血CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg比率及Foxp3mRNA均明顯低于非特應征喘息組，而總IgE較非特應征喘息組高，且各組差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2和圖2、3。

2.3 CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg百分率及 Foxp3 mRNA與總IgE相關分析 CD4＋CD25higTreg及Foxp3mR－NA與總IgE相關分析呈負相關（r＝－0.75，r＝－0.61，P＜0.01）；而該組CD4＋CD25＋Treg與總IgE相關分析呈正相關（r＝0.36，P＜0.05）。

圖2 特應征喘息組和非特應征喘息組CD4＋CD25＋Treg占CD4＋T細胞的比率與對照組比較

圖3 特應征喘息組和非特應征喘息組CD4＋CD25higTreg占CD4＋T細胞的比率與對照組比較

3 討 論

Sakaguchi［1］于1995年首先描述 CD4＋CD25＋Treg是一個有免疫抑制特性的T細胞群，在應答單克隆抗－CD3或抗原刺激不會增殖，且能夠抑制CD4＋CD25－T細胞的增殖應答，占未免疫的小鼠和健康人外周CD4＋T細胞總數的5%～10%。根據CD4＋T細胞表達CD25的程度不同，CD4＋CD25＋Treg又可分為CD4＋CD25higTreg和CD4＋CD25lowTreg，在小鼠中，兩類細胞都有免疫活性，而有人認為在外周血中起免疫活性的是前者［2］。Foxp3是鑒別Treg的一個特異性標志物［3－4］，也是CD4＋CD25＋Treg發展和功能維持的關鍵轉錄因子。Foxp3基因缺失使CD4＋CD25＋Treg抑制活性消失，而Foxp3在CD25－Treg異位表達則可恢復抑制活性［3－5］。目前研究表明，Foxp3主要表達于CD4＋CD25higTreg，達97%左右［6］。人Foxp3基因突變表現為IPEX（免疫失調、多內分泌腺病、腸病、X連鎖綜合征），包括上升的IgE應答和變應性皮炎［7－8］。

目前研究顯示支氣管哮喘是Th2介導的以氣道高反應、可逆的氣流受阻、氣道嗜酸粒細胞侵潤、氣道黏液高分泌及血清高IgE為特征的氣道慢性炎癥性疾病。目前一般認為，哮喘患者體內存在有Th1／Th2平衡改變，Th1細胞受到抑制，而Th2細胞異常活化，通過分泌IL－4、IL－5、IL－13等細胞因子促進B細胞合成IgE分子，刺激內皮細胞表達更多黏附分子，使炎性細胞向病變局部浸潤。隨研究深入，Treg可能在支氣管哮喘和其他過敏性疾病中也起重要作用。長期暴露在哮喘發生時CD4＋Treg向Th2細胞偏移是因為Treg未形成，減少Treg數量或削弱Treg功能都可能導致哮喘的發生［9］。Hartl等［10］則認為，哮喘兒童肺泡灌洗液中CD4＋CD25higTreg值是下降的，其吸入糖皮質激素與外周血和肺泡灌洗液CD4＋CD25higT細胞比例上升相關。同樣有研究表明，與對照組相比，哮喘兒童 CD4＋CD25＋Treg細胞、IL－10分泌型 CD4＋CD25＋Treg及 TGF－β分泌型CD4＋CD25＋Treg、Foxp3mRNA的數目是下降的，CD4＋CD25＋Treg下降可能與哮喘發病機制相關［11］。

嬰幼兒喘息多有反復發作的可能，它的發病機制目前仍不十分清楚，與特應性體質、環境因素等有關，與哮喘可能存在相似的免疫學發病機制［12］。嬰幼兒哮喘早期即存在氣道炎癥反應和氣道重塑，而早期干預可防止肺功能長期、不可逆的損害。如何在喘息發作初期發現潛在的哮喘患兒成為當今研究的關鍵。本實驗結果顯示，喘息嬰幼兒CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg百分率及外周血Foxp3的表達明顯低于對照組，Treg及Foxp3可能在嬰幼兒喘息的疾病活動中起重要作用，可能參與嬰幼兒喘息的發病機制。

特應征是由IgE介導的，以Th2占優勢的免疫應答所表達。特應征個體針對致敏原的Th2應答而非特應征個體不會，目前一個可能的解釋是Treg的影響，其有助于提高對變應原和其他炎癥刺激的免疫耐受［13］。本研究顯示，喘息特應征組CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg比非特應征組顯著降低，與朱亞飛等［14］研究報道呼吸道合胞病毒感染毛細支氣管炎特應征喘息組CD4＋CD25＋Treg比非特應征組降低一致，表明變應原特異的Treg在嬰幼兒變應性喘息個體是有缺陷的。另外，本實驗發現喘息特應征組CD4＋CD25higTreg與總IgE呈負相關，為此他推測CD4＋CD25higTreg參與嬰幼兒變應性喘息的發生發展過程，外周血下降的CD4＋CD25higTreg數目導致免疫抑制功能下降，從而導致Th2細胞大量增殖活化，IgE抗體分泌增加，產生大量致炎因子從而引起喘息發作，外周血CD4＋CD25higTreg比例可能是一個較好反映細胞免疫功能的參考指標，有可能對首次喘息嬰幼兒預后的早期預測有重要價值，今后有必要增加病例數及進行進一步隨訪和相關研究。而有趣的是，作者同時發現特應征喘息組CD4＋CD25＋Treg與總IgE呈正相關，這表明CD4＋CD25＋Treg有可能與特應征狀態相關，在變應原暴露和隨后的Treg激活下表達增加。已有報道在特應性皮炎個體，具有正常的抑制活性的CD4＋CD25＋Treg有正常的或相對高的數值［15－16］；哮喘個體，在急性加重期CD4＋CD25＋Treg是顯著增加的［17－18］。作者這部分研究與該兩篇報道存在相似性。Lee等［19］認為，來自相對嚴重特應征表型的個體，其CD4＋CD25＋Treg升高有可能代表在過敏性疾病加重時，作為一種免疫應答產生的誘導的或適應性T調節細胞。作者的進一步研究將對這些Treg進行更深入的認識，識別哪些部分Treg是真正的效應性T調節細胞。此外，本實驗與朱亞飛等［14］報道呼吸道合胞病毒感染毛細支氣管炎CD4＋CD25＋Treg與總IgE呈負相關不一致，可能原因為本實驗為首次喘息患兒，發病機制與呼吸道合胞病毒這種單一特殊病毒感染并非完全一致。同樣作者發現，Foxp3的表達也與IgE呈負相關，因此推測在嬰幼兒喘息的發病中可能存在Foxp3基因表達降低而導致Treg主要是CD4＋CD25higTreg下降而不能發揮正常的免疫抑制功能，而誘導Foxp3基因表達增加，進而誘導Treg增加是治療嬰幼兒喘息的重要機制之一。

綜上所述，喘息嬰幼兒有下降的CD4＋CD25＋Treg、CD4＋CD25higTreg及Foxp3表達，特應征組更為顯著，表明下降的Treg有可能代表喘息嬰幼兒尤其是特應征喘息兒的一種缺陷。

［1］ Sakaguchi S.Naturally arising Foxp3－expressing CD4＋CD25＋T regulatory T cells in immunological tolerance to self and non－self［J］.Nat Immunol，2005，6（4）：345－352.

［2］ Baecher－Allan C，Brown JA，Freeman GJ，et al.CD4＋CD25higregulatory cells in human peripheral blood［J］.J Immunol，2001，167（3）：1245－1253.

［3］ Hori S，Nomura T，Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3［J］.Science，2003，299（5609）：1057－1061.

［4］ Fontenot JD，Rudensky AY.A well adapted regulatory contrivance：regulatory T cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3［J］.Nat Immunol，2005，6（4）：331－337.

［5］ Fontenot JD，Gavin MA，Rudensky AY.Foxp3programs the development and function of CD4＋CD25＋regulatory T cells［J］.Nat Immunol，2003，4（4）：330－336.

［6］ 焦志軍，尤海燕，陳蕾，等.流式細胞術檢測表達Foxp3的CD4＋CD25＋Treg［J］.臨床檢驗雜志，2008，26（3）：161－163.

［7］ Wildin RS，Freitas A.IPEX and FOXP3：clinical and research perspectives［J］.J Autoimmunity，2005，25Suppl：56－62.

［8］ Wildin RS，Smyk－Pearson S，Filipovich AH.Clinical and molecular features of the immunodysregulation，polyendocrinopathy，enteropathy，X linked（IPEX）syndrome［J］.J Med Genet，2002，39（8）：537－545.

［9］ Umetsu DT，DeKruyff RH.The regulation of allergy and asthma［J］.Immunol Rev，2006（212）：238－255.

［10］Hartl D，Koller B，Mehlhorn AT，et al.Quantitative and functional impairment of pulmonary CD4＋CD25hi regulatory T cells in pediatric asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，2007，119（5）：1258－1266.

［11］Zu Y，Li CR，Zheng YJ，et al.The role of CD4＋CD25＋regulatory T cells in the pathogenesis of asthma in children［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2006，86（1）：35－38.

［12］Legg JP，Hussain LR，Warner JA，et al.Type 1and type2cytokines imbalance in acute respiratory syncytial virus bronchiolitis［J］.AmJ Respir Crit Med，2003，168（6）：633－639.

［13］Tournoy KG，Hove C，Grooten J，et al.Animal models of allergen－induced tolerance in asthma：are T－regulatory－Tcells（Tr1）the solution for T－helper－2cells（Th－2）in asthma［J］.Clin Exp Allergy，2006，36（1）：8－20.

［14］朱亞非，朱建央，李衛武，等.毛細支氣管炎CD4＋CD25＋Treg和Foxp3mRNA表達及與IgE關系［J］.中國當代兒科雜志，2009，11（5）：349－353.

［15］Ou LS，Goleva E，Hall C，et al.T regulatory cells in atopic dermatitis and subversion of their activity by superantigens［J］.J Allergy Clin Immunol，2004，113（4）：756－763.

［16］Vukmanovic－Stejic M，McQuaid A，Birch KE，et al.Relative impact of CD4＋CD25＋regulatory T cells and tacrolimus on inhibition of T－cell proliferation in patients with atopic dermatitis［J］.Br J Dermatol，2005，153（4）：750－757.

［17］Gemou－Engesaeth V，Bush A，Kay AB，et al.Inhaled glucocorticoid therapy of childhood asthma is associated with reduced peripheral blood T cell activation and"Th2－type"cytokine mRNA expression［J］.Pediatr，1997，99（5）：695－703.

［18］Shi HZ，Li S，Xie ZF，et al.Regulatory CD4＋CD25＋T lymphocytes in peripheral blood from patients with atopic asthma［J］.Clin Immunol，2004，113（2）：172－178.

［19］Lee JH，Yu HH，Wang LC，et al.The levels of CD4＋CD25＋regulatory T cells in paediatric patients with allergic rhinitis and bronchial asthma［J］.Clin Exp Immunol，2007，148（1）：53－63.