腺嘌呤致大鼠睪丸損傷中標志酶的變化及淫羊藿總黃酮的干預作用＊

張作濤，謝高宇，陳 凱，齊敏友，劉浩然

（1.貴陽中醫學院基礎醫學院解剖學教研室 550002；2.浙江工業大學藥學院藥理教研室，杭州310042；3.湖南大學化學化工學院藥理學教研室，長沙410082）

腺嘌呤為制作慢性腎功能衰竭動物模型的常用試劑［1］，但研究發現它也可造成下丘腦－垂體－性腺軸的損害，引起睪丸退行性病變［2］。淫羊藿為補腎壯陽的常用中藥。本實驗以中藥化學技術提取分離淫羊藿的總黃酮成份，干預腺嘌呤所誘導的大鼠睪丸病變，觀察其藥物療效。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑及儀器 腺嘌呤（Adenine）為美國AMRESCO公司產品，由南京生興生物技術有限公司分裝（批號：1012S07）。淫羊藿總黃酮（total flavonoids of herba epimedii，TFE）由湖南中醫藥大學科研中心提供，含總黃酮達77.4%；維生素E購自西南合成制藥股份有限公司（批號：101214）；甲基睪酮購自天津飛鷹制藥股份有限公司（批號：101103）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、γ－谷氨酰轉肽酶（gamma－glutamyl transpeptidase，γ－GT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）試劑盒由南京建成生物工程有限公司提供。睪酮、促卵泡成熟激素（follicle－stimulating hormone，FSH）、促黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）檢測試劑盒由天津九鼎生物工程有限公司提供。主要儀器包括SP－752分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、HH－4數顯恒溫水浴箱（金壇環宇科學儀器有限公司）、GC－1200γ放射免疫計數器（科大創新股份有限公司中佳分公司）。

1.2 TFE的提取 小檗科植物淫羊藿經石油醚脫脂，以70%乙醇提取，聚酰胺柱層析分離［3］。以鹽酸－鎂粉法及薄層層析初步檢識為黃酮類。參照中國藥典TFE測定方法，以淫羊藿苷為參照化合物，采用紫外分光光度法在270nm處檢測總黃酮含量為77.2%。

1.3 腺嘌呤致大鼠睪丸病變模型的制作 Sprague Dawley雄性大鼠70只，180～220g，由浙江醫學科學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（浙）2008－0033。將其隨機分為5組：正常對照組、模型組、TFE組、維生素E組和甲基睪酮組，每組14只。除正常對照組外，其余每組大鼠均予腺嘌呤150mg／kg灌胃，1次／d，連續14d，建立大鼠睪丸病變模型［4］。從第15天開始，正常對照組與模型組大鼠予蒸餾水灌胃。TFE組、維生素E組和甲基睪酮組大鼠分別予TFE 100mg／kg，維生素E 10mg／kg及甲基睪酮5mg／kg灌胃，均1次／d。30d后處死大鼠，檢測相關指標。

1.4 觀察指標

1.4.1 臟器指數 處死大鼠，取出睪丸、附睪、精囊腺，精密稱量上述臟器及大鼠質量并計算臟器指數，臟器指數＝臟器質量／體質量。

1.4.2 生化檢測 取大鼠血清以放射免疫法檢測睪酮、FSH及LH含量。取同一側睪丸組織以生理鹽水制成勻漿，檢測LDH、ACP、γ－GT、SOD、GSH－Px活性及 M DA含量。

1.5 統計學處理 采用PASW18.0軟件進行統計學分析，計量數據用±s表示，組間比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA），以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 TFE對性腺及附屬性器官臟器指數的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠睪丸、附睪、精囊腺與體質量的比值（臟器指數）均有下降（P＜0.05），其中睪丸、精囊腺的臟器指數下降較為明顯。與模型組比較，TFE組、維生素E組及甲基睪酮組大鼠睪丸指數分別提高35.9%、25.3%及38.5%；TFE組及甲基睪酮組大鼠精囊腺指數分別提高43.5%、34.4%；TFE組、維生素E組及甲基睪酮組大鼠的附睪指數略有提高，但無統計學差異（P＞0.05）。見表1。

2.2 TFE對睪丸中γ－GT、LDH、ACP及睪酮的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠睪丸中γ－GT、LDH、ACP活力分別下降46.0%、49.3%、50.8%（P＜0.05）。TFE及甲基睪酮組大鼠γ－GT活力相對于模型組提高33.9%、27.7%、35.7%；TFE、維生素E及甲基睪酮組ACP活力相對于模型組分別提高40.4%、19.6%、27.5%。見表2。

表1 TFE對腺嘌呤致衰老大鼠睪丸、附睪、精囊腺臟器指數的影響

表2 TFE對腺嘌呤致衰老大鼠睪丸中γ－GT、LDH及ACP的影響

表3 TFE對腺嘌呤致衰老大鼠睪丸中SOD、GSH－Px及MDA的影響

2.3 TFE對睪丸中SOD、GSH－Px及 MDA的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠睪丸中SOD、GSH－Px活力明顯降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，TFE組、維生素E組大鼠睪丸中SOD活性分別升高30.4%、37.6%；維生素E組大鼠睪丸中GSH－Px活性升高29.2%；TFE組、維生素E組大鼠睪丸中MDA含量分別降低20.2%、27.2%；甲基睪酮組大鼠睪丸中上述指標無明顯變化（P＞0.05）。見表3。

2.4 TFE對血清睪酮的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠血清睪酮及LH顯著下降。與模型組比較，TFE組、甲基睪酮組大鼠睪酮水平分別提高37.5%、43.0%，LH水平分別提高25.5%、30.6%；各組大鼠FSH水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 TFE對腺嘌呤致衰老雄性大鼠血清睪酮、FSH、LH的影響

3 討 論

腺嘌呤通過間接和直接的方式造成睪丸功能的低下。它可導致大鼠慢性腎功能衰竭，繼而通過下丘腦－垂體－睪丸軸的多個水平影響睪丸功能［5－6］。慢性腎功能衰竭影響LH脈沖式釋放、提高血清催乳素水平，釋放尿毒癥毒素［7－10］。同時，腺嘌呤在體內代謝時由黃嘌呤氧化酶產生大量自由基，可直接影響合成睪酮的酶類（如17β羥基類固醇脫氫酶）的活性而致睪酮分泌減少［11］。除了上述內分泌因素外，睪丸功能還受到局部生化因素的影響。睪丸中的特異性生化酶類主要為LDH、ACP和γ－GT。LDH主要存在于睪丸生精細胞內，參與能量代謝，并與生精上皮成熟有關；ACP主要存在于睪丸Sertoli細胞中，參與蛋白質合成；γ－GT則可促進精子的成熟［12］。腺嘌呤造成大鼠類似人類由“腎陽虛”所致的睪丸病變，是制作實驗動物模型的常用試劑。本實驗中，TFE使腺嘌呤模型大鼠睪丸、精囊腺臟器指數相對模型組明顯提高，標志性酶類γ－GT、LDH及ACP的活性增強，睪酮水平提高，且具有一定的抗氧化作用。與甲基睪酮相比，TFE在改善睪丸標志性生化酶類活力及抗氧化方面優于前者，但其對血清睪酮值的改善低于前者。與維生素E相比，TFE在改善睪丸標志性酶類活力、提高血清睪酮方面優于前者，但抗氧化作用弱于前者。從相關分析來看，推測LDH的活力可能主要受氧化應激的影響，而γ－GT可能與睪酮分泌相關，ACP則與二者都有一定的關系。因此，僅提高睪酮的含量或僅改善氧化應激似乎均不能對睪丸損傷起到較為全面的改善作用。TFE降低脂質過氧化代謝產物MDA的含量，且升高SOD的活性，這與以往實驗報道結果一致［13－14］。TFE含多個黃酮類化合物，它們均具有酚羥基［15］，可能在代謝過程中通過自身的氧化而減輕組織的損傷，TFE的抗氧化作用有利于保護睪丸組織，但其特異性并不強。而睪酮對睪丸組織的曲細精管、生精細胞、Sertoli細胞的發育卻是不可或缺的因素。因此，抗氧化與促進睪酮水平的提高是改善腺嘌呤所致睪丸病變中的兩個重要因素，綜合實驗結果來看，TFE兼具抗氧化及提高睪酮水平的作用。淫羊藿在臨床上用于腎陽不足、精氣虛虧所致的性欲低下、陽萎以及因少精、精子活力低下所致的不育癥［16］。上述實驗結果表明TFE具有明顯改善腺嘌呤致大鼠睪丸損傷的作用，其機制可能是促進性激素釋放及抗氧化作用。

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