康膚霜對糖尿病大鼠燙傷創(chuàng)面愈合的作用＊

龔震宇，童亞林△，萬友華，楊潤生，蘇曉玲

（中國人民解放軍第181醫(yī)院：1.燒傷整形科；2.病理科；3.動物實驗中心，廣西桂林541002）

燒傷患者合并糖尿病在臨床中較常見，這類患者的創(chuàng)面愈合較困難，常發(fā)展成經(jīng)久不愈的潰瘍，極大地影響了臨床治療效果［1］?？的w霜為燒傷創(chuàng)面外用藥物，動物實驗證實其對急、慢性創(chuàng)面的愈合具有明顯促進作用［2－4］。本實驗在已建立的新型糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面模型的基礎(chǔ)上，觀察康膚霜對該模型創(chuàng)面愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級 Wistar雄性大鼠24只，體質(zhì)量（220±25）g，由桂林醫(yī)學(xué)院動物中心提供（合格證號：SCXK桂2007－0001）。本實驗經(jīng)解放軍第181醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑及藥物 重組人表皮生長因子（recombinant human epidermal growth factor，rhEGF）凝膠購自桂林華諾威基因藥業(yè)有限公司（批號：20060601）；聚維酮碘為長沙雨花消毒藥有限公司產(chǎn)品（批號：20070727／59）；四氧嘧啶為美國Sigma公司產(chǎn)品（批號：GA－14908）；增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）鏈霉親和素－生物素－過氧化物酶復(fù)合物（streptavidin biotin－peroxidase complex，SABC）免疫組織化學(xué)染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司（克隆編號PC10）?？的w霜為鋅、冰片、洗必泰、水溶性基質(zhì)、少量維生素A及維生素E按一定比例配制的水包油型白色霜劑，由解放軍第181醫(yī)院自行研制。

1.1.3 儀器 主要儀器包括：One Touch血糖儀（美國強生公司）、Olympus BX51型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）、DP－70圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司）、自動控時調(diào)壓燙傷儀（解放軍第181醫(yī)院研制，發(fā)明專利號200610114104.4）。

1.2 實驗方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立 實驗前大鼠禁食12h，測血糖，選取空腹血糖低于7.0mmol／L的大鼠，尾靜脈注射四氧嘧啶溶液（40mg／kg），注射后自由飲食，1周后測隨機血糖，若血糖超過11.1mmol／L，持續(xù)4周，并伴有體質(zhì)量減輕，多飲、多食、多尿，即可認為建模成功［5］。

1.2.2 糖尿病大鼠燙傷模型的建立［6］取成功建模的糖尿病大鼠24只，采用10%硫化鈉水溶液于大鼠背部脫毛，24h后確認脫毛區(qū)無損傷。采用1%戊巴比妥鈉（30mg／kg）大鼠腹腔注射，麻醉成功后，在大鼠背部脊柱兩側(cè)標出4個直徑為1.5cm的圓形區(qū)域（左、右側(cè)各2個，前后創(chuàng)面相距4cm）。采用自動控時調(diào)壓燙傷儀致傷，設(shè)定高壓鍋內(nèi)壓力為300mmHg（0.04kPa），溫度為106℃，燙傷時間為2s，致傷后創(chuàng)面皮膚顏色呈灰白，質(zhì)地均勻一致，病理組織學(xué)檢查證實為深Ⅱ度。

1.2.3 實驗分組 致傷后，將大鼠的4個創(chuàng)面隨機分為康膚霜組、rhEGF組、聚維酮碘組及生理鹽水組，致傷后分別采用康膚霜、rhEGF、聚維酮碘及生理鹽水外敷，藥物完全覆蓋創(chuàng)面，用無菌紗布覆蓋、包扎，膠布固定，每日換藥1次至創(chuàng)面愈合。實驗期間單籠、正常喂養(yǎng)。

1.2.4 實驗觀察 （1）創(chuàng)面大體觀察。每日換藥時肉眼觀察創(chuàng)面情況，包括：創(chuàng)面水腫滲出程度、是否干燥、有無分泌物及創(chuàng)周紅腫變化等，如發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面有異常分泌物，需進行分泌物細菌培養(yǎng)。（2）創(chuàng)面愈合時間。觀察創(chuàng)面上皮完全愈合所需時間，由2位實驗人員分別判定并記錄。（3）創(chuàng)面愈合率。燙傷后第7、14、21天用數(shù)碼相機對傷口進行照相，采用Image Pro Plus（IPP）V6.0圖像分析軟件計算創(chuàng)面愈合面積。按照公式計算創(chuàng)面愈合率［7］：創(chuàng)面愈合率＝（原始創(chuàng)面面積－當前創(chuàng)面面積）／原始創(chuàng)面面積×100%。（4）病理學(xué)及組織學(xué)觀察。燙傷后第7、14、21天各處死6只大鼠，取創(chuàng)面組織行4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，蘇木素－伊紅（hematoxylin－eosin，HE）染色，光鏡下觀察創(chuàng)面組織炎癥細胞浸潤、新生血管形成以及肉芽組織與再上皮化變化的情況。（5）PCNA檢測。采用SABC試劑盒，染色步驟按試劑盒說明書進行，以磷酸鹽緩沖溶液代替第一抗體作為陰性對照，二氨基聯(lián)苯胺（3，3′－diaminobenzidine，DAB）顯色，細胞核呈棕色者為陽性。采用計數(shù)PCNA 標 記指數(shù)（labeling index，LI）方法［8］，在400倍光鏡下觀察染色結(jié)果，每組選取6個視野，每個視野均觀察100個細胞，計算陽性細胞數(shù)，即為標記指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)用±s表示，創(chuàng)面愈合時間差異用單向方差分析；創(chuàng)面愈合率差異用重復(fù)測量方差分析；PCNA標記指數(shù)數(shù)據(jù)用析因分析，采用最小顯著差數(shù)法（the least significant difference，LSD）進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 創(chuàng)面大體觀察 燙傷后見創(chuàng)面呈灰白色，創(chuàng)面中心與周邊色澤均勻、質(zhì)地一致，與周圍正常組織界限明顯。換藥后1～4d，rhEGF組及生理鹽水組創(chuàng)面腫脹、滲出最為明顯，聚維酮碘組次之，康膚霜組最輕。隨著換藥時間延長，創(chuàng)面逐漸好轉(zhuǎn)至完全愈合，4組創(chuàng)面均未出現(xiàn)明顯膿性分泌物，細菌培養(yǎng)均為陰性，見圖1～3。

圖1 燙傷時各組創(chuàng)面大體觀察

圖2 燙傷后第3天各組創(chuàng)面大體觀察

圖3 燙傷后第21天各組創(chuàng)面大體觀察

2.2 創(chuàng)面愈合時間 4組大鼠創(chuàng)面愈合時間由長到短分別為：生理鹽水組［（26.37±1.0）d］、聚維酮碘組［（23.83±0.75）d］、rhEGF組［（22.33±1.03）d］及康膚霜組［（20.67±1.03）d］。4組大鼠創(chuàng)面愈合時間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝36.86，P＜0.05）。

2.3 創(chuàng)面愈合率 燙傷后第7、14、21天創(chuàng)面愈合率統(tǒng)計結(jié)果顯示：康膚霜組大鼠創(chuàng)面的愈合率高于其余3組，4組大鼠創(chuàng)面愈合率兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝1239.09，P＜0.05）。各組創(chuàng)面愈合率隨時間推移明顯升高（P＜0.05），3個時間點的大鼠創(chuàng)面愈合率兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.4 病理學(xué)及組織學(xué)觀察 燙傷后第7天康膚霜組光鏡下可見真皮乳頭層充血、水腫不明顯，炎癥細胞浸潤及壞死組織較其他3組少。燙傷后第14天康膚霜組創(chuàng)面的毛細血管數(shù)、毛細血管內(nèi)皮細胞數(shù)及成纖維細胞數(shù)較其他3組多，肉芽組織生長也更旺盛。燙傷后第21天康膚霜組創(chuàng)面上皮化較完全，新生上皮細胞分化較好，新生上皮組織較厚，有較多的表皮釘腳深入真皮層，而其他3組新生上皮組織較薄，未見有表皮釘腳形成。見圖4。

表1 燙傷后不同時間各組創(chuàng)面愈合率的比較±s，%，n＝6）

表1 燙傷后不同時間各組創(chuàng)面愈合率的比較±s，%，n＝6）

組別燙傷后時間（d）7 14 21生理鹽水組10.83±1.12 43.76±0.70 75.43±0.89聚維酮碘組 16.12±0.40 48.81±0.76 78.65±0.45 rhEGF組 19.80±1.09 61.73±0.79 89.25±0.98康膚霜組20.83±0.78 64.63±1.54 96.37±1.34

圖4 燙傷后第7、14、21天生理鹽水組與康膚霜組創(chuàng)面組織的光鏡觀察（HE×100）

圖5 燙傷后第7、14、21天生理鹽水組與康膚霜組創(chuàng)面組織的PCNA陽性表達（SABC×100）

表2 燙傷后不同時間各組PCNA標記指數(shù)比較±s，%，n＝6）

表2 燙傷后不同時間各組PCNA標記指數(shù)比較±s，%，n＝6）

組別燙傷后時間（d）7 14 21生理鹽水組14.67±1.86 36.83±2.48 42.17±2.14聚維酮碘組 17.33±1.37 40.83±1.17 46.50±1.87 rhEGF組 28.50±1.05 73.33±2.16 63.33±2.34康膚霜組32.83±1.47 76.33±2.00 67.67±2.94

2.5 PCNA在創(chuàng)面組織中的表達 燙傷后第7、14天4組大鼠創(chuàng)面組織的PCNA主要表達于腺體、毛囊上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞；燙傷后第21天4組大鼠創(chuàng)面組織的PCNA主要表達于新生上皮的基底細胞、基底層以上的部分表皮細胞、腺體和毛囊的上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞。4組大鼠燙傷后第14、21天創(chuàng)面組織均可見少量成纖維細胞PCNA的陽性表達，見圖5?？的w霜組PCNA標記指數(shù)高于其他3組，4組大鼠創(chuàng)面組織的PCNA標記指數(shù)兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。標記指數(shù)隨時間推移明顯升高（F＝2 174.78，P＜0.05）；第14、21天與第7天比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），第14天與第21天比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

3 討 論

實驗先采用尾靜脈注射四氧嘧啶法建立糖尿病大鼠模型，燙傷后4周大鼠一直維持較高的血糖水平，不同的時間點血糖無明顯波動。在此糖尿病大鼠模型上，采用自行研制的自動控時調(diào)壓燙傷儀建立深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面大鼠模型，大體及病理結(jié)果證實該模型創(chuàng)面燙傷深度均勻、界限清楚，是一種較理想的糖尿病燙傷創(chuàng)面動物模型。

實驗結(jié)果顯示，與其他3組比較，康膚霜組糖尿病大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的愈合速度最快，創(chuàng)面愈合時間最短，創(chuàng)面愈合率最高，表明康膚霜能促進燙傷創(chuàng)面愈合。病理組織學(xué)顯示康膚霜能明顯減輕燙傷創(chuàng)面早期的炎癥反應(yīng)。rhEGF是促進上皮細胞生長的重要因子之一，動物實驗及臨床試驗顯示其具有加速糖尿病創(chuàng)面愈合的作用［9－10］。本實驗表明康膚霜促進創(chuàng)面愈合的作用優(yōu)于rhEGF。PCNA是增殖細胞核內(nèi)DNA聚合酶δ（DNApolymeraseδ，polδ）的一種輔助因子，與真核細胞S期的DNA的復(fù)制有關(guān)［11］，是反映細胞增殖狀態(tài)的一個重要指標［12－14］。皮膚組織中的PCNA主要定位于表皮基底層細胞、毛囊上皮細胞、內(nèi)皮細胞和部分成纖維細胞的細胞核內(nèi)，在皮膚組織的發(fā)生與修復(fù)過程中表達增強。實驗結(jié)果顯示康膚霜組PCNA標記指數(shù)高于其他3組，說明康膚霜對創(chuàng)面組織細胞的增殖有明顯的促進作用，能加快創(chuàng)面再上皮化，促進創(chuàng)面愈合。

糖尿病創(chuàng)面愈合困難主要與2個環(huán)節(jié)有關(guān)：（1）合成分泌膠原的組織細胞功能異常；（2）調(diào)控細胞外基質(zhì)的生長因子及其他調(diào)控因子的功能異常。在創(chuàng)面愈合過程中，這些涉及不同環(huán)節(jié)的功能異常相互作用，構(gòu)成了創(chuàng)面愈合困難的基礎(chǔ)［15］。康膚霜是由鋅、冰片、洗必泰、水溶性基質(zhì)、少量維生素A及維生素E按一定比例配制成的水包油型白色霜劑。維生素A可促膠原蛋白交聯(lián)及組織內(nèi)沉積；加速創(chuàng)面上皮化；增強巨噬細胞吞噬創(chuàng)面壞死組織，釋放細胞生長因子、血管內(nèi)皮細胞生長因子及纖維連接蛋白的作用［16］。鋅不僅能夠提高生長激素水平，使后者對胰島素樣生長因子－1誘導(dǎo)作用增強，而且對表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）及其受體的表達有促進作用，從而加速表皮細胞增殖和膠原的沉積，促進創(chuàng)面愈合［17］。維生素E可降低毛細血管通透性，與維生素A都有抗氧化作用［18］?？的w霜外敷創(chuàng)面可使局部潮濕、缺氧。潮濕環(huán)境有利于間生態(tài)組織恢復(fù)活力。低氧環(huán)境可刺激毛細血管增生，改善局部血液循環(huán)；加速壞死組織的溶解；促進多種生長因子的釋放；利于表皮細胞的遷移及間生態(tài)組織恢復(fù)活力［19］。但潮濕環(huán)境也利于細菌繁殖，康膚霜成分中的洗必泰、冰片具有抗菌、消炎作用［20－21］，結(jié)合及時清創(chuàng)與換藥，可避免創(chuàng)面感染，為加速創(chuàng)面修復(fù)提供良好的局部環(huán)境。本實驗證實康膚霜具有明顯加快糖尿病燙傷創(chuàng)面愈合的作用，這與康膚霜中多種配方成分的綜合促愈合作用有關(guān)，對于其促進糖尿病創(chuàng)面愈合的機制尚需進一步深入研究。

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