三氧化二砷逆轉A549細胞對TRAIL耐藥的研究＊

王績英，趙雪強，王昌明，莫碧文，蔣 明，陳 峰

（桂林醫學院附屬醫院呼吸內科，廣西桂林541001）

在各種常見腫瘤中男性肺癌的發病率和死亡率最高，女性肺癌的發病率位居第4，死亡率位居第2。在中國，肺癌的發病率逐年上升［1］。由于大多數肺癌患者確診時已屬晚期，失去了手術機會，使放、化療成為肺癌綜合治療的主要手段，但大多數肺癌患者對目前的常規化療藥物不敏感，因此，迫切需要尋求新的、更有效的化療藥物。腫瘤靶向治療是以腫瘤細胞的某些關鍵蛋白作為靶點，特異性殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞沒有不良反應。在本研究中，將人非小細胞肺癌A549細胞用腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（tumor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）、三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）處理，觀察A549細胞的增殖與凋亡，以及TRAIL和As2O3對A549細胞核因子kappa B（nuclear factor－kappa B，NF－κB）、半胱－天冬 氨 酸 蛋 白 酶 （cysteinyl aspartate specific protease，caspase）－3、survivin mRNA 表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 人非小細胞肺癌A549細胞為實驗室自行傳代保存。重組人TRAIL為以色列PROSPEC公司產品，As2O3注射液為哈爾濱伊達藥業公司產品，Dulbecco′s改良Eagle培養（Dulbecco′s modified Eagle′medium，DMEM）、Trizol、AMV第一鏈cDNA合成試劑盒及聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）System購自TAKARA公司。引物序列見表1，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 細胞培養及分組 將A549細胞置于含10%胎牛血清、100U／mL青霉素及100μg／mL鏈霉素的DMEM培養基中培養，待細胞處于對數生長期時將其分為對照組（僅加入DMEM）及實驗組，實驗組又分為As2O3（1μmol／L組As2O3處理）、TRAIL組（100μg／L TRAIL處理）及聯合組（1μmol／L As2O3與100μg／L TRAIL聯合處理）。

表1 PCR引物序列

1.3 四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法檢測 將對數生長期的細胞以每孔200μL，2 000個／孔的細胞密度接種于96孔板，待細胞貼壁后按上述分組處理細胞，每組設3個復孔，同時設空白對照（僅加培養基）。培養24、48、72h后終止實驗，每孔加5mg／mL MTT 20μL，繼續培養4h，棄掉培養基，每孔加二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）200μL，震蕩5min，使沉淀充分溶解。用酶標儀測490nm吸光度（absorbance，A）值。按公式計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率（%）＝［（對照組A值－實驗組A值）／對照組A值］×100%。

1.4 流式細胞儀檢測 取對數生長期細胞接種于6孔板中，每孔4×104個細胞，培養12h后，用含0.5%胎牛血清的DMEM繼續培養24h，使細胞周期同步化。按上述分組處理細胞，每組設3個復孔，培養48h后收集細胞，制成單細胞，70%冷乙醇固定，4℃過夜，檢測前用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌，加入20μL核糖核酸酶A（RNaseA），37℃孵育30min，避光加碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液，冰浴30min，以300目篩網過濾。調整細胞密度為1.0×106／mL后以流式細胞儀檢測，激發光源為氬離子，激發波長488nm，用Multicycle DNA分析軟件行細胞凋亡率測定。

1.5 逆轉錄－PCR（reverse transcriptase－PCR，RT－PCR）檢測各組細胞于藥物干預48h后提取總RNA。總RNA提取按TAKARA公司提供的試劑操作步驟操作。AMV第一鏈cDNA合成試劑盒反轉錄為cDNA，再經PCR擴增。NF－κB擴增條件如下：94℃預變性3min后，94℃變性15s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環；最后72℃延伸5min。survivin擴增條件如下：94℃預變性3min后，94℃變性15s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環；最后72℃延伸5min。caspase－3擴增條件如下：94℃預變性3min后，94℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環；最后72℃延伸5min。PCR產物用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統分析，計算相對表達量（與β－actin的比值）。

1.6 統計學處理 應用SPSS16.0軟件進行統計學分析，計量數據用±s表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 As2O3、TRAIL對A549細胞增殖的影響 As2O3組、TRAIL組A549細胞與對照組比較，細胞增殖的差異沒有統計學意義。聯合組A549細胞增殖作用明顯強于As2O3組及TRAIL組，且具有時間依賴性（P＜0.05），見表2。

表2 As2O3及TRAIL對A549細胞的增殖抑制作用（±s，%，n＝3）

表2 As2O3及TRAIL對A549細胞的增殖抑制作用（±s，%，n＝3）

＊：P＜0.05，與As2O3組比較；△：P＜0.05，與TRAIL組比較。

組別細胞增殖抑制率24h 48h 72h As2O3組4.3±1.4 15.7±2.7 18.1±4.2 TRAIL組 3.8±1.7 12.8±2.0 15.2±4.2聯合組 12.7±1.3＊△ 27.3±2.5＊△ 42.7±3.5＊△

2.2 As2O3、TRAIL對A549細胞凋亡的影響 凋亡的細胞通透性增加，細胞膜上會出現小漏洞，在洗滌和染色的過程中小片段DNA從細胞內丟失，使凋亡細胞的DNA含量低于正常細胞，在流式細胞儀DNA直方圖上出現典型的亞二倍體凋亡峰。聯合組 A549細胞的凋亡率為（28.73±1.55）%，而As2O3組和TRAIL組細胞凋亡率分別為（13.23±1.99）%和（5.92±2.48）%。聯合組分別與As2O3組和TRAIL組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 As2O3、TRAIL 對 A549 細 胞 NF－κB、survivin 及caspase－3mRNA表達的影響

2.3.1 As2O3、TRAIL對 A549細胞 NF－κB mRNA表達的影響 與對照組比較，經As2O3、TRAIL處理48h后，各實驗組A549細胞 NF－κB mRNA 的表達下降，聯合組細胞 NF－κB mRNA表達下降尤為明顯（P＜0.01），見圖1。

圖1 對照組、TRAIL組、As2O3組及聯合組A549細胞NF－κB mRNA 的表達

2.3.2 As2O3、TRAIL對 A549細胞survivin mRNA 表達的影響 與對照組比較，經As2O3、TRAIL處理48h后，各實驗組A549細胞survivin mRNA的表達下降，聯合組細胞survivin mRNA表達下降尤為明顯（P＜0.01），見圖2。

圖2 對照組、TRAIL組、As2O3組及聯合組A549細胞survivin mRNA的表達

2.3.3 As2O3、TRAIL對 A549細胞caspase－3mRNA表達的影響 各實驗組A549細胞經As2O3、TRAIL處理48h后，與對照組比較，As2O3組A549細胞caspase－3mRNA的表達增強，TRAIL組A549細胞caspase－3mRNA的表達沒有明顯變化；與As2O3組和TRAIL組比較，聯合組A549細胞caspase－3mRNA的表達明顯增強（P＜0.01），見圖3。

圖3 對照組、TRAIL組、As2O3組及聯合組A549細胞caspase－3mRNA的表達

3 討 論

TRAIL是新發現的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族成員，TRAIL通過與其受體［死亡受體（death receptor，DR）4、DR5］結合而啟動死亡途徑，激活Caspase級聯反應，最終激活caspase－3發生生物效應，從而引發對TRAIL敏感的細胞大量、快速凋亡，而對機體正常組織不具有明顯的毒性作用［2］。因此，TRAIL可能是一種很好的腫瘤靶向治療藥物。但近年來的研究發現，盡管TRAIL具有良好的特異性，仍面臨抗腫瘤藥普遍存在的耐藥性問題，人們發現大部分肺癌細胞對TRAIL耐藥，TRAIL的耐藥機制目前仍不十分清楚［3－4］。作者推測化療藥物與TRAIL聯用也許可逆轉TRAIL的耐藥性。As2O3是傳統中藥砒石的主要成分，是一種劇毒化合物。目前研究發現As2O3對急性早幼粒細胞性白血病具有誘導細胞凋亡的作用，并已在臨床應用，同時，As2O3可逆轉部分腫瘤細胞的耐藥性。本實驗通過流式細胞術檢測發現TRAIL組的凋亡率僅有（5.92±2.48）%，而聯合組的凋亡率為（28.73±1.55）%。

多藥耐藥（mutidrug resistance，MDR）是影響腫瘤化療效果的重要原因。目前MDR的機制仍不完全清楚，人們認為由于 MDR1基因編碼的跨膜 P－糖蛋白（P－glycoprotein，P－gp）、MRP1基因編碼的跨膜糖蛋白使細胞內的藥物排出或分布異常，使藥物不能在細胞內達到有效濃度［5－6］。但這一機制還不能完全闡明 MDR。研究表明，MDR與細胞凋亡有關。Survivin是目前發現的較強的凋亡抑制蛋白，具有調控細胞增殖和凋亡作用，Survivin和肺癌的耐藥性與疾病預后有關［7－9］。RT－PCR檢測顯示聯合組A549細胞survivin mRNA的表達明顯下降，而caspase－3mRNA的表達明顯增強。

NF－κB具有顯著抑制腫瘤細胞凋亡的功能，它與腫瘤的發生、生長和轉移等多個環節密切相關。NF－κB的持續激活刺激細胞生長，導致細胞增殖失控［10］。但NF－κB的作用卻有爭議，Ehrhardt等［11］認為NF－κB在TRAIL凋亡信號轉導過程中發揮負向調節作用，阻止細胞發生凋亡。Shetty等［12］則得出相反的結論，認為NF－κB促進TRAIL凋亡信號的發生，并認為NF－κB亞單位的種類及數量是這一作用的關鍵。有研究證實Survivin參與了 NF－κB介導的抗細胞凋亡全過程，存在NF－κB－Survivin途徑［13－15］。

TRAIL與As2O3聯用對A549細胞的增殖抑制作用及誘導凋亡作用明顯強于As2O3或TRAIL單獨應用的作用。在聯合組中可觀察到細胞NF－κB mRNA的表達明顯下降，這說明As2O3可能是通過NF－κB通路下調survivin mRNA，上調caspase－3mRNA的表達，從而解除survivin對caspase－3的抑制而逆轉A549細胞對TRAIL的耐藥性。As2O3能否在體內增強TRAIL的凋亡誘導作用，還有待進一步的研究。

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