慢性乙型肝炎患者外周血Th17細胞的表達及臨床意義＊

孫 強，湯 偉△，汪曉鶯

（1.南通大學附屬醫院感染科，江蘇南通226001；2.南通大學醫學院免疫學教研室，江蘇南通226001）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染呈世界性流行，但不同地區HBV感染的流行情況存在很大差異。據WHO報道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性HBV感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化及原發性肝細胞癌［1］。HBV體內持續感染導致慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的機制尚未完全闡明，白細胞分化抗原 （cluster of differentiation，CD）4陽性T細胞與CHB的關系引起人們的注意，并發現輔助性T細胞（helper T cell，Th）1／Th2平衡失調及調節性 T細胞（regulatory T cell，Treg）功能異常可促進CHB的發生、發展及惡化［2－3］。近年來研究人員發現了一群不同于Th1、Th2及Treg的細胞亞群，它們不表達白介素（interleukin）－4或干擾素（interferon，IFN）－γ，卻大量分泌IL－17，被命名為 Th17細胞［4－5］。新近研究報道，Th17細胞在感染性疾病、自身免疫性疾病以及腫瘤中均發揮重要的調節作用。目前，Th17細胞是否參與HBV感染后CHB的發生、發展，它與肝臟的炎癥損傷是否存在內在聯系等均未見報道。本研究擬通過觀察CHB患者外周血Th17細胞頻率、血清IL－17水平及其與臨床指標的相關性，探討Th17與CHB的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇29例南通大學附屬醫院感染科門診和住院確診的CHB患者作為CHB組，其中，男17例，女12例；年齡17～56歲，平均37.8歲。診斷參照2005年中華醫學會肝病學分會、感染病學分會修定的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準。所有病例均除外其他病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝炎、自身免疫性肝病及遺傳性肝病等，且未經任何抗病毒或免疫調節藥物治療。另選17例健康體檢者作為對照組，其中，男10例，女7例；年齡18～51歲，平均32.9歲；均無肝炎病史，肝炎病原學血清標志物檢測為陰性，肝功能各項指標正常。

1.2 主要試劑與儀器 主要試劑：IL－17A－PE、CD4－PerCPCy5.5抗體及同型對照購自美國eBioScience公司，佛波醇酯、離子霉素及布雷菲德菌素 A（Brefeldin A，BFA）購自瑞士Alexis公司，Fix＆Perm（Reagent A、Reagent B）為美國Invitrogen公司產品，IL－17酶聯免疫吸附測定（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司，HBV血清標志物ELISA試劑盒購自廈門英科新創科技有限公司，HBV核酸擴增熒光定量檢測試劑盒購自中山達安生物技術有限公司，丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒為日本協和醫藥株式會社產品。主要儀器：流式細胞儀（美國BD公司）、Rotor－Gene熒光實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀及7600型全自動生化分析儀（日本日立公司）。

1.3 外周血Th17細胞頻率的檢測 采集健康人和CHB患者全血100μL（新鮮肝素鈉抗凝），用RPMI 1640培養基100μL稀釋，加入1μg／mL佛波醇酯工作液5μL，50μg／mL離子霉素工作液4μL及0.5mg／mL BFA工作液4μL。37℃、5%CO2培養箱培養6h。加入CD4－PerCP－Cy5.5抗體10μL，室溫避光溫育15min。將其分為2管，每管100μL，編號為a和b。分別加入Fix＆Perm中的Reagent A（即固定液）100μL，室溫、避光溫育15min，分別加入磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）3mL，離心5min（離心半徑8cm，1 200r／min），棄除上清液。分別加入Fix＆Perm中的Reagent B（即破膜和溶血液）100μL，同時在a管中加10μL鼠IgG，b管中加入10μL IL－17A－PE，室溫、避光溫育15min。每管加PBS 3mL，離心5min（離心半徑8cm，1 200 r／min），棄除上清液。加入0.5mL PBS重懸細胞，采用流式細胞儀檢測。

1.4 血清細胞因子IL－17水平的檢測 采用ELISA法檢測CHB患者和健康人外周血血清IL－17的水平，嚴格按試劑盒說明書進行檢測。

1.5 血清HBV DNA、HBV標志物、ALT的檢測 采用熒光實時定量PCR法檢測患者血清HBV DNA水平；ELISA法檢測HBV標志物；采用速率法檢測血清ALT（日立7600型全自動生化分析儀）。

1.6 統計學處理 應用SPSS11.5軟件進行統計學分析，計量數據用±s表示。組間Th17細胞頻率、IL－17水平的比較采用兩獨立樣本的t檢驗；血清ALT水平與Th17細胞，HBV DNA與Th17細胞的相關分析采用Pearson相關檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 外周血Th17細胞頻率的檢測 采用流式細胞術多色熒光分析法檢測外周血Th17細胞頻率，CHB組患者和對照組健康體檢者外周血Th17細胞頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。將CHB患者分為 HBV e抗原（HBV e antigen，HBeAg）陽性組與HBeAg陰性組，兩組患者外周血Th17細胞頻率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），結果見表1。對照組中1例健康體檢者和CHB組中1例CHB患者外周血Th17細胞頻率分別為9.20%和12.11%，見圖1、2。

表1 各組人員外周血Th17細胞頻率、血清IL－17水平的比較（±s）

表1 各組人員外周血Th17細胞頻率、血清IL－17水平的比較（±s）

＊：P＜0.05，與對照組比較。

組別 n Th17頻率（%） IL－17（ng／mL）對照組17 9.18±1.20 4.15±1.59 CHB組 29 11.58±1.85＊ 6.32±2.44＊HBeAg陽性組 16 12.17±1.62 6.26±2.68 HBeAg陰性組13 10.85±1.92 6.38±2.20

2.2 外周血中血清IL－17水平的檢測 CHB組患者和對照組健康體檢者外周血血清IL－17水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。將CHB患者分為HBeAg陽性組與HBeAg陰性組，兩組患者外周血血清IL－17水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05），結果見表1。

圖1 對照組（1例）外周血Th17細胞頻率

圖2 CHB組（1例）外周血Th17細胞頻率

2.3 CHB患者Th17細胞頻率與HBV DNA載量、血清ALT的直線相關性分析 CHB組患者外周血Th17細胞頻率與血清ALT水平正相關（r＝0.582，P＜0.01），而 Th17細胞頻率與 HBV DNA載量無明顯相關性（r＝－0.213，P＞0.05）。

3 討 論

HBV在機體持續性感染所致CHB發生的機制尚未完全闡明。HBV是一種非細胞毒性病毒，當其進入機體后常可引起一系列復雜的免疫反應，而機體產生免疫應答的強弱又與HBV感染所致的不同臨床結果密切相關。在這一系列免疫應答中，細胞免疫應答是決定HBV感染后疾病轉歸的重要因素，不同T細胞亞群對病毒抗原的反應不同，即對病情輕重及疾病轉歸的影響不同。目前的研究認為，HBV造成的肝損害及其轉歸與機體的細胞免疫關系密切，其中T淋巴細胞作為主要的效應細胞，與病毒的清除和肝細胞的損傷直接相關［6］，效應CD4＋T細胞是機體免疫應答的重要成員，并在免疫調節中發揮關鍵作用。效應CD4＋T細胞只有在應答恰當時，才能建立有效的宿主免疫體系并維持免疫記憶。但如果效應CD4＋T細胞失調，則會導致機體產生嚴重的炎癥性損傷，如自身免疫疾病和自身炎癥性疾病等。

根據細胞的功能，將CD4＋T細胞分為Th1、Th2細胞及Treg細胞3個亞群［7－8］。最近人們發現一群不同于Th1、Th2及Treg的細胞亞群，它們不表達IL－4或IFN－γ，卻高表達IL－17，因此，命名為Th17細胞。Th17細胞主要通過其分泌的細胞因子IL－17A、IL－17F、IL－6、IL－22及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF－α）等發揮作用，其中最主要的是IL－17A，也稱為IL－17，其受體在體內廣泛表達。IL－17是一種重要的炎癥介質，它可通過誘導其他炎癥細胞因子，如IL－6、TNF－α及趨化因子等的表達介導炎癥細胞的局部浸潤及組織損傷；IL－17也參與中性粒細胞、樹突狀細胞的增殖、成熟及趨化過程［9］。Th17細胞在多種疾病中發揮著重要的效應作用。在感染性疾病中，Luzza等［10］發現胃、十二指腸幽門螺旋桿菌感染后外周血IL－17水平增加；牙周炎也出現血清IL－17表達水平的升高，這些提示IL－17參與了細菌感染后的炎癥反應［10－11］；在腫瘤方面，有學者發現胃癌患者外周血 Th17細胞及其相關因子IL－23、IL－17明顯高于健康人，且外周血Th17細胞頻率與胃癌的分期有關，晚期胃癌患者頻率較高［12］；在自身免疫性疾病中，研究人員發現潰瘍性結腸炎和克羅恩病患者炎癥急性期的腸黏膜內有大量Th17細胞存在；在類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化癥以及炎癥性疾病中Th17細胞發揮了重要的調節作用；同時Th17細胞也與自身免疫性血液病如再生障礙性貧血有密切關系。另外，有研究發現急性冠狀動脈綜合征患者外周血Th17細胞頻率增加，IL－17、IL－23水平升高，Th17細胞可能參與不穩定動脈粥樣斑塊和急性冠狀動脈綜合征的發病［13－16］。

本實驗對CHB患者外周血Th17細胞頻率及其分泌的IL－17變化進行研究，結果表明CHB患者外周血Th17細胞頻率明顯高于健康人群，同時CHB患者外周血IL－17水平也明顯高于健康人群，提示CHB患者體內存在較多的Th17細胞及其相關分泌因子的高表達。為探討Th17細胞及其細胞因子在CHB發病過程中的作用，本實驗進一步對CHB患者組外周血血清HBV DNA載量、ALT進行檢測，發現CHB患者組外周血Th17細胞頻率與血清ALT水平正相關（P＜0.01），這一現象提示CHB患者Th17細胞通過大量分泌IL－17發揮生物學作用，誘導中性粒細胞、巨噬細胞的聚集，加重肝臟損害。而CHB患者外周血Th17細胞頻率與HBV DNA載量無明顯相關性，提示Th17細胞的多少與病毒含量的直接關系并不大，但其與病毒感染后引起的免疫反應或組織損傷有關。

綜上所述，本研究初步表明Th17細胞可能在CHB的發生、發展中發揮重要作用，但Th17細胞的功能、分布特點及其與CHB持續感染的免疫機制還有待進一步探討。

［1］ 中華醫學會肝病學分會，感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南［S］.中華肝臟病雜志，2005，13（12）：881－891.

［2］ 福軍亮，徐東平，趙平，等.急慢性乙型肝炎患者外周血調節性T細胞鑒定與臨床意義分析［J］.中華醫學雜志，2006，86（22）：1522－1525.

［3］ 辛永寧，宣世英，孫櫻.慢性乙型肝炎Th1／Th2細胞的免疫功能研究進展［J］.臨床肝膽病雜志，2005，21（3）：182－184.

［4］ 李佳，陳小平.Th效應細胞家族的新成員——Th17［J］.中國免疫學雜志，2007，23（11）：1048－1051.

［5］ Park H，Li Z，Yang XO，et al.A distinct lineage of CD4T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17［J］.Nat Immunol，2005，6（11）：1133－1141.

［6］ Rehermann B，Nascimbeni M.Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection［J］.Nat Rev Immunol，2005，5（3）：215－229.

［7］ Murphy KM，Reiner SL.The lineage decisions of helper T cells［J］.Nat Rev Immunol，2002，2（12）：933－944.

［8］ Reiner SL.Development in motion：helper T cells at work［J］.Cell，2007，129（1）：33－36.

［9］ Kolls JK，Lindén A.Interleukin－17family members and inflammation［J］.Immunity，2004，21（4）：467－476.

［10］Luzza F，Parrello T，Monteleone G，et al.Up－regulation of IL－17is associated with bioactive IL－8expression in Helicobacter pylori－infected human gastric mucosa［J］.J Immunol，2000，165（9）：5332－5337.

［11］Johnson RB，Wood N，Serio FG.Interleukin－11and IL－17 and the pathogenesis of periodontal disease［J］.J Periodontol，2004，75（1）：37－43.

［12］Zhang B，Rong G，Wei H，et al.The prevalence of Th17 cells in patients with gastric cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，374（3）：533－537.

［13］Chabaud M，Durand JM，Buchs N，et al.Human interleukin－17：A T cell－derived proinflammatory cytokine produced by the rheumatoid synovium［J］.Arthritis Rheum，1999，42（5）：963－970.

［14］郭寧紅，石慶之.Th17細胞與自身免疫性血液病［J］.重慶醫學，2010，39（18）：2533－2535.

［15］余嫻，程翔，廖玉華，等.急性冠狀動脈綜合征患者Th17細胞檢測及意義［J］.臨床心血管病雜志，2008，24（2）：145－148.

［16］R?hn TA，Jennings GT，Hernandez M，et al.Vaccination against IL－17suppresses autoimmune arthritis and encephalomyelitis［J］.Eur J Immunol，2006，36（11）：2857－2867.