缺氧環境肝癌SMMC－7721細胞ABCG2和HIF－1α的表達及其關系

卿小松，孔憲炳

（重慶醫科大學附屬第一醫院肝膽外科 400016）

三磷腺苷結合盒轉運體G2（ATP－binding cassette transporter G2，ABCG2）是近年來發現的三磷腺苷結合盒（ATP－binding cassette，ABC）轉運體蛋白家族新成員。研究表明，ABCG2參與了多種腫瘤的發生、發展及耐藥，并能維持干細胞特性［1－2］。缺氧誘導因子－1α（hypoxia－inducible factor－1alpha，HIF－lα）是目前發現的介導細胞低氧反應最關鍵的核轉錄因子，它可促進血管形成，維持細胞氧及代謝平衡，以保證腫瘤生長，并導致化療耐受［3－4］。本實驗研究了在缺氧條件下人肝癌SMMC－7721細胞ABCG2和HIF－1α表達的變化，探索二者表達的關系，并進一步探討缺氧誘導ABCG2表達的可能機制，為抗腫瘤治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌SMMC－7721細胞株由重慶醫科大學普外科學重點實驗室提供。RPMI 1640培養基、小牛血清購于Gibco公司；抗HIF－1α多克隆兔抗人抗體購自Santa Cruz公司；抗ABCG2多克隆兔抗人抗體購自武漢博士德公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗兔第二抗體及增強化學發光（enhanced chemiluminecence，ECL）試劑盒購于碧云天生物技術公司；HIF－lα抑制劑3－（5′－羥甲基－2′－呋喃 ）－1－芐 基 吲 唑 ［3－（5′－hydroxymethyl－2′－furyl）－1－benzylindazole，YC－1］購自Cayman公司；全細胞裂解液及聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自博海生物有限公司。

1.2 細胞培養 SMMC－7721細胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培養基中培養，將其分為對照組及缺氧組。對照組在5%CO2、37℃培養箱中培養。待細胞生長至60%匯合狀態時，缺氧組細胞放入含1%O2、94%N2、5%CO2混合氣體的培養箱培養，根據缺氧時間，缺氧組再分為缺氧24h組、缺氧48h組及缺氧72h組。

1.3 HIF－1α與ABCG2蛋白的檢測 收獲培養的各組細胞，按照全細胞裂解液說明書提取細胞總蛋白，二辛可寧酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定總蛋白濃度。取50μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至PVDF膜上，麗春紅染色證實轉移成功，5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原，第一抗體封閉過夜，第二抗體37℃孵育1h。第一抗體HIF－1α抗體1∶100稀釋，ABCG2抗體1∶100稀釋，第二抗體工作濃度均為1∶1 000。ECL顯影，Bio－Rad凝膠成像系統采集圖片，將 HIF－1α與ABCG2灰度值分別與甘油醛－3－磷酸脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）灰度值的比值作為蛋白表達水平的參數，對產物相對定量，實驗重復3次。

1.4 YC－1抑制 SMMC－7721細胞 HIF－1α表達后對 ABCG2表達的影響 將缺氧72h組SMMC－7721細胞加入 HIF－1α抑制 劑 YC－1，按 YC－1 終 濃 度 分 為 YC－1 1.0、2.0 及4.0μmol／L組，將不含 YC－1的缺氧72h組SMMC－7721細胞設為YC－1對照組。各組分別處理24h后，采用Western blot檢測各組細胞中HIF－1α、ABCG2蛋白的表達。實驗重復3次。

1.5 統計學處理 所有數據采用SPSS17.0軟件行統計學分析，數據以±s表示，行SNK方差分析及Pearson相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 缺氧環境SMMC－7721細胞 HIF－1α、ABCG2蛋白的表達 Western blot結果顯示，與對照組比較，在缺氧條件下SMMC－7721細胞中 HIF－1α蛋白表達上調，HIF－1α的表達在缺氧24h時即開始增加，48h穩步上升，72h達到高峰，各缺氧組SMMC－7721細胞HIF－1α的表達與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1、表1。ABCG2的表達趨勢同HIF－1α的表達，二者表達呈正相關（r＝0.944，P＜0.05），表明隨著缺氧的加劇，HIF－1α與ABCG2蛋白表達逐漸增加。

圖1 Western blot檢測缺氧環境SMMC－7721細胞HIF－1α與ABCG2蛋白的表達

表1 Western blot檢測SMMC－7721細胞中 HIF－1α與ABCG2蛋白的表達（±s）

表1 Western blot檢測SMMC－7721細胞中 HIF－1α與ABCG2蛋白的表達（±s）

＊：P＜0.05，與對照組比較；＃：P＜0.05，與缺氧24h組比較；△：與缺氧48h組比較。

組別 HIF－1αABCG2對照組0.184±0.017 0.087±0.017缺氧24h組 0.289±0.044＊ 0.166±0.019＊缺氧48h組 0.385±0.044＊ 0.227±0.034＊缺氧72h組 0.608±0.090＊＃△ 0.344±0.061＊＃△

圖2 不同濃度 YC－1對SMMC－7721細胞 HIF－1α、ABCG2蛋白表達的影響

2.2 YC－1抑制 SMMC－7721細胞 HIF－1α表達后對 ABCG2表達的影響 Western blot檢測結果顯示，隨著YC－1濃度的增加，缺氧72h組SMMC－7721細胞中HIF－1α蛋白表達逐漸減少，同時 ABCG2表達亦逐漸下降，除 YC－1 1.0μmol／L組與YC－1 2.0μmol／L組比較，差異無統計學意義外，其余各組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖2、表2。

表2 不同濃度 YC－1對 HIF－1α、ABCG2表達的影響（±s）

表2 不同濃度 YC－1對 HIF－1α、ABCG2表達的影響（±s）

＊：P＜0.05，與對照組比較；＃：P＜0.05，與 YC－1 1.0μmol／L組比較；△ ：與 YC－1 2.0μmol／L組比較。

組別 HIF－1αABCG2 YC－1對照組0.615±0.059 0.509±0.087 YC－1 1.0μmol／L組 0.387±0.054＊ 0.287±0.039＊YC－1 2.0μmol／L組 0.315±0.030＊ 0.239±0.033＊YC－1 4.0μmol／L組 0.085±0.020＊＃△ 0.105±0.019＊＃△

3 討 論

ABCG2首次發現于乳腺癌 MCF－7／Adr－Vp3000細胞系，因此，又稱為乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）［5］。隨著研究的深入，人們發現它在多種腫瘤組織及腫瘤細胞中亦有表達［6－7］。ABCG2作為一種轉運體，可以將多種化學結構不同的藥物“泵出”細胞外，其轉運的藥物包括：多柔比星、米托蒽醌、長春新堿、紫杉醇及拓撲替康等，其介導的多藥耐藥（multi－drug resistance，MDR）是導致臨床化療失敗的原因之一［8－9］。腫瘤生長快，代謝旺盛，耗氧量大，而腫瘤內部的血管生成則相對較慢，因而缺氧幾乎是所有實體瘤微環境的共同特征。缺氧時細胞內亞鐵血紅素、卟啉類化合物等物質大量堆積，它們可破壞細胞DNA、蛋白質及包膜脂質。此外，缺氧微環境還是造成化療耐藥的原因之一。

趙大偉等［10］發現ABCG2蛋白在正常肝組織及肝硬化組織中均有表達，呈弱陽性。在肝癌組織中，ABCG2表達約2／3呈弱陽性，1／3呈強陽性；ABCG2表達水平與腫瘤直徑及數目有關。ABCG2還是肝癌側群細胞表型的主要因素，后者具有腫瘤干細胞特性，而腫瘤干細胞目前被認為是維持腫瘤生長及化療失敗的根本原因［10－12］。因此，ABCG2可能對維持肝癌生長和化療耐藥發揮重要作用。本研究發現，缺氧環境中SMMC－7721細胞ABCG2的表達較常氧環境中的表達增加，這與Krishnamurthy等［13］的研究結果相符。同時本實驗結果還顯示，ABCG2的表達隨缺氧時間的延長而增加，隨著缺氧加劇，細胞能量供求矛盾突出，細胞內糖酵解途徑代謝物不斷積累，腫瘤細胞上調ABCG2表達以將這些代謝產物排出體外，抵抗缺氧帶來的傷害，而由此導致的ABCG2表達增加可能是缺氧下腫瘤細胞耐藥的機制之一。

HIF－lα在細胞缺氧信號途徑中處于核心位置，它可以促進新生血管形成，維持氧及代謝平衡，以保證腫瘤生長和促進其轉移，并引起化療耐受［3］。本研究發現，在缺氧時SMMC－7721細胞HIF－lα的表達強于常氧環境，并隨著時間延長而增加，這表明在持續缺氧條件下，腫瘤細胞可通過上調HIF－lα的表達來維持氧及代謝平衡，促進細胞生長，而這種表達趨勢也與相關文獻報道一致［14］。

本研究還發現，ABCG2和 HIF－1α在SMMC－7721細胞中的表達水平隨著缺氧信號的加強而呈現出一致的增高趨勢，且二者表達呈正相關。有關研究顯示，HIF－1α可調控40余種基因的表達，諸如MDR1便是其調控的靶基因之一［15］，而MDR1基因編碼產物 P－糖蛋白（P－glycoprotein，P－GP）與 ABCG2同屬ABC轉運體家族，這就提示ABCG2是HIF－1α的下游目的基因，HIF－1α可上調ABCG2的表達。為了證明這一假設，本研究采用 HIF－1α抑制劑YC－1干預 HIF－1α的表達，發現隨著YC－1濃度的增加，HIF－1α的表達水平逐漸下降，更重要的是，ABCG2的表達亦逐漸降低，這表明ABCG2是HIF－1α的相關調控蛋白，缺氧對ABCG2的調控是通過HIF－1α的機制而實現的。

綜上所述，缺氧環境中，SMMC－7721細胞ABCG2和HIF－1α的表達上調，并隨時間延長而增加，YC－1抑制HIF－1α后可有效下調ABCG2的表達。本實驗表明缺氧時SMMC－7721細胞生存及耐藥的機制可能是通過缺氧誘導HIF－1α的表達而實現，后者上調ABCG2的表達，增強了腫瘤細胞對缺氧環境的適應能力及化療抵抗能力。抑制HIF－1α－ABCG2這一途徑有望成為治療肝癌以及逆轉肝癌患者耐藥的治療靶點。

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