顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者血清差異蛋白質(zhì)譜表達(dá)模型的研究

周 杰，陳禮剛，李定君，黃昌仁，劉洛同，明 揚(yáng)，張 苓，李 昊

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，四川瀘州646000）

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤一旦破裂會(huì)帶來(lái)極嚴(yán)重后果，而在其破裂之前如能早期發(fā)現(xiàn)并給予積極治療，可明顯降低患者的致殘率和病死率，因此，對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的篩查及治療具有重要意義。但目前這方面的研究尚少［1－2］。本實(shí)驗(yàn)擬采用表面增強(qiáng)激光解吸／離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（surface－enhanced laser desorption／inionation－time of flight－mass spectra，SELDI－TOF－MS）技術(shù)篩選顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者血清特異蛋白標(biāo)記物，建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型，為早期、無(wú)創(chuàng)篩選顱內(nèi)動(dòng)脈瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入病例為2007年7月至2010年12月本院神經(jīng)外科收治的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者。將45例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂患者作為破裂組，其中，男26例，女19例；年齡（45.1±7.1）歲。同時(shí)期收治的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤未破裂患者作為未破裂組，其中，男28例，女17例；年齡（46.2±6.5）歲。將45例同時(shí)期于本院門(mén)診部體檢的健康者作為對(duì)照組，其中，男23例，女22例；年齡（47.1±6.9）歲。所有顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者經(jīng)計(jì)算機(jī)斷層掃描血管造影（computed tomography angiography，CTA）、數(shù)字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）檢查證實(shí)，均無(wú)動(dòng)脈瘤和蛛網(wǎng)膜下腔出血家族史、腦出血及遺傳性疾病史。

1.2 主要試劑與儀器 芥子酸、乙腈、三氟乙酸、甲醇、Tris－HCl、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）、丙酮及甲酸等均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。金屬親和表面蛋白芯片、PBSⅡ／C型蛋白質(zhì)指紋圖譜儀系統(tǒng)均為美國(guó)Ciphergen公司產(chǎn)品。

1.3 標(biāo)本收集 所有受試者清晨空腹，于前臂靜脈采血5mL，4℃下靜置30min，2h內(nèi)送本院檢驗(yàn)科蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)室。4℃下離心5min（離心半徑8cm，3 000r／min），取上清液（即血清）放入－80℃冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，從－80℃冰箱中取出樣本，冰上融解0.5～1.0h，4℃下離心2min（離心半徑8cm，10 000r／min），待用。

1.4 芯片檢測(cè) 吸取10mL芥子酸溶液（芥子酸溶于50%乙腈和0.5%三氟乙酸所得的飽和溶液）與血清等量混合，芯片活化，吸取2mL混合液點(diǎn)樣，晾干后再加入1μL芥子酸，室溫下干燥，上機(jī)檢測(cè)。設(shè)定參數(shù)：從相對(duì)分子質(zhì)量為1.0×106開(kāi)始檢測(cè)，檢測(cè)最大相對(duì)分子質(zhì)量為1.0×108，相對(duì)分子質(zhì)量?jī)?yōu)化范圍為2.0×106～2.0×107，激光強(qiáng)度為210，開(kāi)始檢測(cè)靈敏度為9，集中在優(yōu)化中心，用定量的方法獲取數(shù)據(jù)，設(shè)置SELDI參數(shù)位置為20，開(kāi)始位置為20，結(jié)束位置為80，每個(gè)位置平均5次遞增。利用PBSⅡ／C型蛋白質(zhì)指紋圖譜儀對(duì)結(jié)合在芯片表面的血清蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)處理和模型建立 采用Ciphergen Proteinchip軟件自動(dòng)采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Biomarker Wizard 3.1軟件分別分析未破裂組和對(duì)照組（各30例）、未破裂組和破裂組 （各30例）的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜差異，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類(lèi)分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及優(yōu)化，分別建立診斷模型。利用測(cè)試集樣本（各15例）對(duì)模型進(jìn)行雙盲法驗(yàn)證，評(píng)價(jià)模型的準(zhǔn)確性。

2 結(jié) 果

2.1 差異蛋白的檢測(cè) （1）檢測(cè)未破裂組和對(duì)照組血清共獲得135個(gè)蛋白質(zhì)峰，兩組有54個(gè)蛋白質(zhì)峰表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中8個(gè)蛋白質(zhì)峰荷質(zhì)比分布于2 000～20 000之間，兩組比較差異顯著（P＜0.01）。在未破裂組與對(duì)照組血清中篩選差異表達(dá)的2個(gè)蛋白質(zhì)峰分別為3 367.7和5 857.5，兩組血清蛋白指紋圖譜及相應(yīng)的凝膠電泳圖比較見(jiàn)圖1。（2）檢測(cè)未破裂組和破裂組血清共獲得265個(gè)蛋白質(zhì)峰，兩組有79個(gè)蛋白質(zhì)峰表達(dá)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中14個(gè)蛋白質(zhì)峰荷質(zhì)比分布于2 000～20 000之間，兩組比較差異顯著（P＜0.01）。在未破裂組與破裂組血清中篩選差異表達(dá)的2個(gè)蛋白質(zhì)峰分別為6 642.0和9 127.5，兩組血清蛋白指紋圖譜及相應(yīng)的凝膠電泳圖比較見(jiàn)圖2。

2.2 建立篩選預(yù)測(cè)模型 （1）以荷質(zhì)比為2 540.6、3 367.7、5 857.5及8 231.0的4個(gè)蛋白質(zhì)峰作為輸入節(jié)點(diǎn)建立的模型，其模擬計(jì)算的網(wǎng)絡(luò)誤差值最低，其中，以荷質(zhì)比為2 540.6、3 367.7及5 857.5的差異蛋白對(duì)比正常血清表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；荷質(zhì)比為8231.0的差異蛋白對(duì)比正常血清表達(dá)顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)表1。（2）以荷質(zhì)比為 2 938.2、4 065.3、6 642.0、9 127.5及16 021.6的5個(gè)蛋白質(zhì)峰作為輸入節(jié)點(diǎn)建立的模型，其模擬計(jì)算的網(wǎng)絡(luò)誤差值最低。其中，以荷質(zhì)比為2 938.2、16 021.6的差異蛋白對(duì)比破裂組血清表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；荷質(zhì)比為4 065.3、6 642.0及9 127.5的差異蛋白對(duì)比破裂組血清表達(dá)顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)表2。

圖1 未破裂組和對(duì)照組血清的蛋白指紋圖譜及凝膠電泳圖比較

圖2 未破裂組和破裂組血清的蛋白指紋圖譜及凝膠電泳圖比較

表1 4種差異蛋白質(zhì)在未破裂組和對(duì)照組中的質(zhì)譜峰值

2.3 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型的雙盲法驗(yàn)證 利用建立的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型對(duì)測(cè)試集中樣本（各15例）分別進(jìn)行雙盲法測(cè)試。驗(yàn)證結(jié)果顯示：（1）15例未破裂組患者的血清中（目標(biāo)輸出值0.5～1.0）有1例判錯(cuò)；而在15例對(duì)照組患者的血清中（目標(biāo)輸出值0.0～0.5）有1例判錯(cuò)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，其靈敏度為93.3%，特異度為93.3%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為93.3%，陰性預(yù)測(cè)值93.3%。利用結(jié)果數(shù)據(jù)繪制受試者工作特征（receiver operator characteristic curve，ROC）曲線，ROC曲線下面積（area under ROC curve，AUC）為0.920（＞0.7），說(shuō)明該診斷模型準(zhǔn)確，見(jiàn)圖3。（2）15例未破裂組患者的血清中（目標(biāo)輸出值0.5～1.0）有1例判錯(cuò)；而在15例破裂組患者的血清中（目標(biāo)輸出值0.0～0.5）有2例判錯(cuò)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，其靈敏度為93.3%，特異度為86.7%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為87.5%，陰性預(yù)測(cè)值92.9%。利用結(jié)果數(shù)據(jù)繪制的ROC曲線，AUC為0.858（＞0.7），說(shuō)明該診斷模型準(zhǔn)確，見(jiàn)圖4。

表2 5種差異蛋白質(zhì)在未破裂動(dòng)脈瘤和破裂動(dòng)脈瘤組中的質(zhì)譜峰值

圖3 未破裂組與對(duì)照組人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型的ROC曲線分析

圖4 未破裂組與破裂組人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)診斷模型的ROC曲線分析

3 討 論

目前，對(duì)于未破裂動(dòng)脈瘤的篩選工作開(kāi)展較少，尚缺乏快捷、行之有效的方法對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤進(jìn)行早期篩選和預(yù)測(cè)。DSA和CTA是目前診斷顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的主要手段，但它們不能作為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的大規(guī)模篩選手段［3－4］。近年來(lái)越來(lái)越多的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤在例行體格檢查或因其他原因行頭部磁共振成像、磁共振血管造影（magnetic resonance angiography，MRA）檢查時(shí)被發(fā)現(xiàn)，因MRA無(wú)創(chuàng)、無(wú)輻射，且在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的診斷方面具有一定價(jià)值，相對(duì)DSA、CTA而言，它更適合用于人群的篩查。但作為篩查手段，MRA存在檢查時(shí)間長(zhǎng)、噪音大、費(fèi)用高的弊端，且MRA可能漏診或誤診較小動(dòng)脈瘤和大動(dòng)脈瘤［5］。鑒于動(dòng)脈瘤破裂后的嚴(yán)重后果，確立可靠的無(wú)創(chuàng)篩查手段具有重要意義。

目前，尚不清楚顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制，它可能與遺傳、血流動(dòng)力學(xué)以及后天退行性變等多種因素相關(guān)。研究表明基因突變、缺失以及表達(dá)異常在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，因此，從分子水平上研究顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行基因診斷和治療成為該領(lǐng)域的最新研究方向［6］。蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展極大地推動(dòng)了疾病生物標(biāo)志物的研究，它可以從整體水平上對(duì)一個(gè)細(xì)胞、一種組織中所包含的全部蛋白質(zhì)進(jìn)行時(shí)間和空間上的動(dòng)態(tài)研究［7－8］。因此，對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者血清蛋白指紋圖譜的研究有可能發(fā)現(xiàn)特異性顱內(nèi)動(dòng)脈瘤診斷的生物標(biāo)志。SELDI－TOF－MS技術(shù)檢測(cè)的基本原理是基于特殊芯片的表面加強(qiáng)吸附，芯池中的分析物經(jīng)激光脈沖輻射，解吸形成荷電離子，不同荷質(zhì)比的離子在儀器漂移管中飛行的時(shí)間不同，質(zhì)量越小，所帶電荷越多的離子，其荷質(zhì)比越小，飛行時(shí)間越短，檢測(cè)器可對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)并繪制成質(zhì)譜圖，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理后形成模擬圖譜［9］，將對(duì)照組與某種疾病或疾病不同階段的圖譜進(jìn)行比較，可發(fā)現(xiàn)和捕捉特異相關(guān)蛋白。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)在于：（1）可分析經(jīng)典技術(shù)無(wú)法分析的蛋白質(zhì)，包括疏水蛋白質(zhì)、等電點(diǎn)過(guò)高或過(guò)低的蛋白質(zhì)；（2）獲得的圖譜單一，重復(fù)性好，可用于定量分析；（3）樣品無(wú)需純化，可分析復(fù)雜的生物樣品，增加發(fā)現(xiàn)生物學(xué)標(biāo)志的機(jī)會(huì)；（4）樣品需要量少，檢測(cè)速度快，適合臨床診斷及大規(guī)模篩選。近年來(lái)，它已被廣泛用于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和定義、蛋白質(zhì)功能分析、腫瘤標(biāo)志物篩選及藥學(xué)研究等領(lǐng)域，同時(shí)，對(duì)顱腦損傷和顱內(nèi)腫瘤進(jìn)行的初步研究顯示其在這一領(lǐng)域也具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，但目前尚無(wú)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道［10－14］。

SELDI－TOF－MS技術(shù)的應(yīng)用為大規(guī)模人群篩選提供了可能。Zhang等［15］運(yùn)用SELDI－TOF－MS技術(shù)建立的診斷模型檢測(cè)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的特異度和敏感度均為94%，檢測(cè)預(yù)后不良患者的特異度為92%，敏感度為94%。呂晶晶等［16］用結(jié)直腸腺瘤患者、結(jié)直腸良性疾病患者及正常人血清的3種表達(dá)差異蛋白質(zhì)的荷質(zhì)比建立診斷模型，該模型的診斷準(zhǔn)確率為87.70%、靈敏度為71.43%、總特異度為96.25%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為90.91%。本研究結(jié)果表明運(yùn)用SELDI－TOF－MS技術(shù)檢測(cè)未破裂組、破裂組及對(duì)照組患者的血清標(biāo)本，獲取相應(yīng)血清蛋白表達(dá)指紋圖譜，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析以篩選未破裂組患者血清可能存在的特異蛋白是可行的，未破裂組、破裂組及對(duì)照組患者血清蛋白質(zhì)譜的表達(dá)具有顯著的差異性。根據(jù)不同分組的差異蛋白，運(yùn)用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型分別建立其診斷模型，其AUC＞0.7，說(shuō)明該方法所建立的診斷模型準(zhǔn)確可靠，可以作為未破裂顱內(nèi)動(dòng)脈瘤患者的潛在篩選手段。雙盲法驗(yàn)證此診斷模型顯示其可在短時(shí)間內(nèi)較好地區(qū)分未破裂動(dòng)脈瘤患者、破裂動(dòng)脈瘤患者及健康者，說(shuō)明該診斷模型適合于未破裂動(dòng)脈瘤的篩選工作。

利用SELDI－TOF－MS技術(shù)篩選的血清特異蛋白標(biāo)志物作為篩選顱內(nèi)動(dòng)脈瘤實(shí)驗(yàn)指標(biāo)具有重要的潛在價(jià)值和一定的應(yīng)用前景。首先，該方法血清樣本容易獲得，對(duì)患者創(chuàng)傷性小，檢查耗時(shí)短，費(fèi)用低，有利于臨床高危人群篩選的應(yīng)用和推廣；其次，通過(guò)對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的蛋白質(zhì)表達(dá)差異情況進(jìn)行研究，進(jìn)而對(duì)差異蛋白數(shù)量、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、相互關(guān)系和生物學(xué)功能進(jìn)行全面分析，明確顱內(nèi)動(dòng)脈瘤血清差異蛋白在此疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用，從而對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤進(jìn)行診斷和篩選，并可對(duì)這些“關(guān)鍵”蛋白進(jìn)行干預(yù)，為基因治療顱內(nèi)動(dòng)脈瘤提供臨床和實(shí)驗(yàn)資料。然而，本研究在諸多方面還需進(jìn)一步深入，如對(duì)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的完善以及實(shí)驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)化，以增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性，并進(jìn)行多中心、大樣本的聯(lián)合研究。通過(guò)對(duì)這些潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行精確鑒定，確定其在動(dòng)脈瘤發(fā)生、發(fā)展、破裂過(guò)程中的具體作用，為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的臨床篩選提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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