鉛對小鼠學習記憶功能影響與突觸囊泡蛋白相關

趙 奇，王 艷，武紅娟，陳 于

（重慶醫科大學公共衛生與管理學院勞動衛生與環境衛生教研室 400016）

鉛是廣泛存在于生產及生活環境中的重金屬元素，長期接觸鉛能夠造成機體多個系統損傷，其中鉛對中樞神經系統的毒性作用越來越被人們重視。有研究表明，長期接觸鉛可導致嚴重的神經毒作用，造成神經行為障礙和認知能力低下等［1－2］。Morris水迷宮實驗是作為檢測實驗大、小鼠空間學習記憶功能常用方法［3］，海馬腦區則是空間學習記憶功能的中樞［4］。突觸囊泡蛋白（Synaptophysin，Syn）是突觸囊泡的一種特異性標志蛋白，與胞吐作用密切相關［5］。Syn變化可間接反映體內突觸的數量和分布情況，與突觸重建及認知過程密切相關，其缺乏可導致學習記憶功能下降［6］。Syn在學習記憶過程中發揮重要作用，并且其與鉛所致學習記憶功能損傷的關系研究較少。本實驗擬對海馬區Syn表達與鉛所致小鼠學習記憶功能損傷關系進行研究，進而探討鉛的神經毒性作用相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級8～9周齡雄性昆明小鼠24只［（購自大坪醫院野戰外科研究所醫學實驗動物中心，許可證編號：SCXK（渝）2007－0005］。動物飼養溫度：（21±2）℃，室內光照12h（光照時間08：00到20：00），動物進食標準基礎飼料，自由進水。適應性喂養1周后，將小鼠隨機分為兩組，對照組和鉛染毒組，每組12只。

1.2 主要試劑及儀器 醋酸鉛（Sigma，美國）純度99.99%，突觸囊泡蛋白單克隆抗體（AB8049，Abcam，美國），驢抗小鼠熒光抗體IRDye800CW（LI－COR，美國），β－actin抗體（Sigma，美國）。MT－200型Morris水迷宮視頻跟蹤系統（成都泰盟，中國），蛋白電泳系統（Bio－Rad，美國），Odyssey紅外熒光掃描成像系統（LI－COR，美國），DM6000B型倒置光學顯微鏡及圖像采集系統（Leica，德國）。

1.3 鉛染毒實驗 鉛染毒組小鼠飼養飲水由醋酸鉛溶于蒸餾水中配制，醋酸鉛濃度2.4mmol／L，劑量參照文獻［7－9］，并經預實驗確定；對照組飲水則為蒸餾水。飼養過程中，籠具、飲水瓶等所有用具均使用不含鉛的制品。各組動物自由進食、飲水，喂養30d后對動物進行各項測試。

1.4 Morris水迷宮實驗 實驗方法參照文獻［10］進行：水池直徑120cm，池深50cm；平臺直徑10cm，位于水面下1cm。水池平分為四個象限，平臺位于其中一象限正中位置，實驗開始后平臺位置固定不變，攝像頭位于迷宮正中上方位置。迷宮內水溫保持在（23±2）℃，池水加奶粉使之渾濁。水迷宮實驗正式開始前24h，各組小鼠均放入迷宮內（無平臺）自由游10次，每次60s，使之適應迷宮內環境。在鉛暴露第30天，對照組和鉛染毒組進行水迷宮定位航行實驗。實驗時，將小鼠面朝水迷宮池壁，隨機從四個象限中的一個象限中點輕輕放入水迷宮。每次訓練設定時限60s，若60s內小鼠找到隱藏在水面下的平臺，則讓小鼠在平臺上停留30s，并記錄其找到隱藏平臺的時間，即逃逸潛伏期；若60s內小鼠未能找到平臺，則將小鼠輕輕引導至平臺上，并使之在平臺上停留30s，逃逸潛伏期記為60s。同時系統會記錄小鼠搜索平臺的軌跡。一次訓練結束后，將小鼠擦干后，放在取暖器旁休息，等待下一次訓練，每次訓練間隔15min，每只小鼠共訓練8次。水迷宮實驗結束后24h，每組隨機取9只小鼠用水合氯醛麻醉，斷頭處死，取其海馬組織，組織凍存于－80℃備用；另外3只小鼠則用于做腦組織切片。

1.5 海馬區HE切片實驗 將水迷宮實驗結束后的兩組中的小鼠各3只，參照文獻［11］方法，取小鼠全腦做連續冠狀切片，常規HE染色后顯微鏡下觀察小鼠鉛染毒后海馬CA1、CA3和齒狀回區神經元變化。

1.6 Western blot實驗 將凍存的組織加RIPA勻漿裂解后，提取海馬組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，上樣量60μg，10%SDS－PAGE電泳，轉膜至NC膜，5%脫脂奶粉的PBS緩沖液封閉。突觸囊泡蛋白單克隆抗體（1∶1000）4℃孵育過夜，TBST洗膜，驢抗小鼠熒光二抗（1∶5 000）室溫孵育1h，洗膜，Odyssey紅外熒光掃描成像系統掃描條帶，用Odyssey系統軟件對目的條帶熒光光密度進行分析。β－actin做內參，兩組結果再行比較。

1.7 統計學處理 兩組小鼠每次水迷宮逃逸潛伏期和Western blot實驗結果，以±s表示，采用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析，檢驗水準α＝0.05。

2 結 果

2.1 Morris水迷宮實驗 （1）各組小鼠連續8次水迷宮實驗逃逸潛伏期結果見表1。結果顯示對照組小鼠隨訓練次數的增加，其逃逸潛伏期逐漸縮短，即搜索到隱藏平臺所用時間逐漸減少。鉛染毒組小鼠學習記憶功能明顯受損，表現為第3次（P＜0.05）、第4次至第8次（P＜0.01）水迷宮實驗，鉛染毒組小鼠逃逸潛伏期與對照組比較顯著延長（P＜0.05）。（2）軌跡圖（圖1）為第8次訓練各組小鼠水迷宮軌跡。從軌跡圖上看，對照組小鼠經過連續8次訓練后，找尋平臺的方向性明確，路徑簡單直接；鉛染毒組小鼠搜索平臺的軌跡與對照組比，目標性不明確，軌跡雜亂，經過訓練雖然能夠找到隱藏的平臺，但其找尋平臺的路徑相對方向性不如對照組準確，無法快速有效搜尋到隱藏的平臺。

表1 兩組小鼠逃逸潛伏期比較（n＝12，±s）

表1 兩組小鼠逃逸潛伏期比較（n＝12，±s）

訓練次數逃逸潛伏期（s）對照組 鉛染毒組第1次60.00±0.00 60.00±0.00第2次 47.92±11.27 55.67±5.92第3次 46.59±14.79 51.09±11.45＊第4次 35.72±13.21 56.34±5.15＃

續表1 兩組小鼠逃逸潛伏期比較（n＝12，±s）

續表1 兩組小鼠逃逸潛伏期比較（n＝12，±s）

＃：P＜0.01，＊：P＜0.05，與對照組比較。

訓練次數逃逸潛伏期（s）對照組 鉛染毒組第5次 27.48±13.70 49.15±13.31＃第6次 32.70±10.80 44.33±12.62＃第7次 25.31±10.84 42.31±8.44＃第8次 26.09±8.56 37.44±11.62＃

2.2 Western blot檢測結果 與對照組比較，鉛染毒組小鼠海馬區中Syn表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖2。

圖1 經過連續8次訓練后各組小鼠水迷宮軌跡圖

2.3 海馬區神經元HE切片形態觀察 結果顯示，鉛染毒組小鼠海馬區較對照組無明顯變化。對照組和鉛染毒組海馬神經元呈帶狀分布，排列整齊，CA1、CA3區錐體細胞及齒狀回區顆粒細胞形態均正常，核居中，大而圓，染為淡藍色，核仁核膜清晰，核仁染為紫色，胞質紅色且著色均勻，見圖3。

圖2 Western blot檢測Syn結果

圖3 兩組小鼠海馬區HE切片結果（×50）

3 討 論

現有研究認為鉛直接的神經毒性主要是促進細胞凋亡、神經系統興奮性中毒及對神經遞質儲存與釋放的影響［12－13］。而本研究結果提示Syn在鉛導致的神經毒性機制中可能亦發揮重要作用。

本研究中，Morris水迷宮實驗結果顯示鉛染毒組小鼠逃逸潛伏期較對照組顯著延長，表明慢性鉛暴露可導致小鼠空間學習記憶功能損傷。由于海馬是空間學習記憶重要腦區，其功能受到抑制時將會導致學習記憶功能下降［14］。

有文獻指出，大鼠長期飲用高鉛水，鉛可通過血―腦屏障對大鼠大腦皮層和海馬組織造成明顯病理損傷，本實驗中并未發現鉛對小鼠海馬造成明顯病理損傷［15］，但 Morris水迷宮卻顯示鉛已經導致了小鼠學習記憶功能損傷，提示鉛導致的學習記憶功能損傷可能并非是單純由其導致的病理變化引起。

Syn與突觸囊泡的胞吐作用密切相關，其變化可間接反映體內突觸的數量和分布情況，與認知過程及突觸重建密切相關，Syn的缺乏可導致學習記憶功能下降［6］。Western blot結果顯示，鉛染毒組小鼠海馬中Syn表達較對照組顯著降低。結合水迷宮實驗和海馬HE切片結果，提示鉛染毒造成的小鼠學習記憶功能損傷，在其出現病理損傷前可能是由于鉛導致小鼠海馬區Syn表達水平降低造成。但是鉛如何通過影響Syn表達進而引起鉛染毒小鼠學習記憶功能損傷，仍需要進一步研究。

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