余海亮，李可洲，劉恒全，黃 楠，蒲 克，駱 樂，姚豫桐

隨著影像技術及生物工程的發展，膽管內支架植入逐漸成為治療膽道良、惡性狹窄非外科手術的主要方法，但支架植入后的膽道損傷、膽道反復感染、細菌生物膜形成、膽泥淤積、膽石形成、腫瘤生長、組織反應增生等［1-2］導致置入支架的膽管再次梗阻，這一直是膽道外科介入治療的難點，其中膽道感染對支架植入后膽道再梗阻的發生和發展呈正相關［3-4］，為了防止支架植入后膽道感染及膽道再狹窄，膽道支架中逐漸改良為藥物涂層支架。

本研究是觀察并評價三氯生在體外低濃度下及加載于膽道支架材料膽汁環境下的抑菌效果，及評價聯合紫杉醇后其抑菌效果，并與臨床常用藥物鹽酸左氧氟沙星相比較，現報告如下。

材料與方法

1 抑菌環實驗

實驗步驟按NCCLS M2-A7(2000年)紙片擴散法［5］標準操作。三氯生-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)-丙酮溶液配制:分別取三氯生0.01g和PLGA 0.02g溶解于99%的化學純丙酮溶液10ml中，三氯生藥物濃度為1mg/ml，再用倍比稀釋法進行稀釋，分別配制成濃度為 A:1mg/ml，B:0.5mg/ml，C:0.25mg/ml，D:0.125mg/ml，E:0.0625mg/ml，F:0.03125mg/ml的三氯生-PLGA-丙酮溶液;鹽酸左氧氟沙星溶液濃度相同;紫杉醇丙酮溶液濃度為0.01mg/ml。試驗重復3次，數據用SPSS 10.0軟件進行方差分析，P＜0.05認為有統計學意義。

2 藥物材料表面涂層體外膽汁浸泡實驗

2.1 滅菌膽汁制備 取新鮮人“T”管引流膽汁100ml，將人膽汁用60Co放射性同位素γ射線輻照滅菌，劑量為8kGy。

2.2 三氯生涂層材料的制備 取316L醫用不銹鋼材料切割成直徑5mm，厚度為2mm的圓形小片，共計12片，再用依次用200目、400目、600目、800目、1000目、1200目砂紙及拋光布機械拋光材料致鏡面;將經蒸餾水、超聲波震蕩洗滌后，高溫消毒，三氯生-PLGA-丙酮溶液(0.25mg/ml)旋轉噴涂于316L醫用不銹鋼材料表面，噴涂旋轉8周，置入真空環境中干燥1h。

2.3 方法 材料表面藥物涂層體外膽汁浸泡實驗 取預先消毒的6×4孔平板，取消毒膽汁4ml分別注入孔內，再滴入兩種配置好的菌懸液0.5ml，振蕩3min后分別加入制備好316L醫用不銹鋼裸材料(A組)、316L醫用不銹鋼+PLGA+三氯生(B組)的材料片，置入37℃振蕩溫箱培養24h后取出觀察結果。

2.4 藥物材料表面涂層體外膽汁浸泡實驗檢測用間接免疫熒光染色標定層黏連蛋白及細菌，用BI-2000醫學圖像分析系統對各組切片單位面積陽性細胞所占百分比進行半定量分析，并用掃描電鏡觀察、拍照浸泡后材料的表面超微結構。所有步驟均嚴格按說明書操作。

2.5 圖像處理和統計學處理 在100倍物鏡下用熒光顯微鏡拍照，對熒光數量進行半定量分析。結果采用χ2檢驗、秩和檢驗，采用SPSS 10.0軟件進行統計，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 抑菌環法檢測結果

在測試的不同三氯生藥物濃度下對大腸桿菌和糞腸球菌的抑菌環均明顯，按規定標準判定有抑菌作用(表1)。與相同濃度的左氧氟沙星藥物相比較，均優于同濃度的左氧氟沙星(P＜0.005);但聯合紫杉醇后，三氯生抑菌效果相對單用三氯生明顯降低(P＜0.005)，與左氧氟沙星比較也無明顯優勢(P＞0.005)。

2 免疫熒光染色結果

如圖1、2所示，三氯生-PLGA涂層的316L醫用不銹鋼材料表面吸附的細菌為8.52%，而316L醫用不銹鋼裸材料表面吸附細菌69.48%，兩者相比有顯著性統計學差異(P＜0.05)，而如圖3、4所示，三氯生-PLGA涂層的材料表面吸附的層黏連蛋白為75.54%，相比之下裸材料表面的為89.81%，兩者之間也有顯著性統計學差異(P＜0.05)。

3 掃描電鏡檢測結果

掃描電鏡可見316L醫用不銹鋼裸材料表面有較多球菌及桿菌呈團塊樣黏附，而三氯生-PLGA表面黏附明顯減少(圖5、6)。

表1 各試驗樣片的平均抑菌環直徑(mm±s)

表1 各試驗樣片的平均抑菌環直徑(mm±s)

兩種陰性對照抑菌環直徑為0mm。試驗用各菌懸液的平均濃度:大腸桿菌:108 7000CFU/ml;糞腸球菌:14304000CFU/ml。與相同濃度的左氧氟沙星藥物相比較:*P＜0.005

濃度 三氯生組 左氧氟沙星組 三氯生+紫杉醇組大腸桿菌 糞腸球菌A 40.23±1.54* 38.55±1.83* 28.75±1.28 30.54±1.87 29.54±1.54 22.64±1.38大腸桿菌 糞腸球菌 大腸桿菌 糞腸球菌12.27±1.83 14.67±1.88 12.86±1.31 7.84±1.87 B 35.44±1.85* 36.64±1.32* 23.63±2.13 28.46±1.75 26.64±1.28 17.39±1.45 C 31.65±1.78* 32.86±1.52* 19.04±1.38 24.53±1.52 19.76±1.25 15.24±1.28 D 27.75±1.18* 28.27±2.18* 17.45±1.76 21.63±1.28 17.86±1.48 11.49±1.83 E 24.26±2.05* 23.69±1.86* 13.93±1.39 17.42±1.86 14.67±1.27 9.48±1.35 F 21.85±1.28* 22.06±1.88*

圖1 三氯生-PLGA涂層表面黏附細菌的熒光標定( ×100)

圖2 316L醫用不銹鋼材料裸材料表面黏附細菌的熒光標定( ×100)

圖3 三氯生-PLGA涂層表面吸附層黏連蛋白的熒光標定( ×100)

圖4 316L醫用不銹鋼裸材料表面吸附層黏連蛋白熒光標定( ×100)

圖5 三氯生-PLGA表面黏附細菌掃描電鏡( ×3000)

圖6 316L醫用不銹鋼裸材料表面黏附細菌掃描電鏡( ×3000)

討 論

在支架置入早期，膽道感染就是加重患者原有膽道梗阻及膽管炎癥狀的根本原因，是導致支架置入后膽道再次阻塞的主要原因。

Neve等［6］報道了膽道梗阻后膽道中最常見的微生物是大腸桿菌(36.6%)，肺炎克雷伯菌(18.3%)，銅綠假單胞菌(8.3%)，普通變形桿菌(8.3%)和凝固酶陰性葡萄球菌(8.3%)。Rerknimitr和 Fogel［7］對支架植入病人膽汁進行培養，并與無支架病員的膽汁進行比較:其中支架置入組的陽性率(98%)明顯高于無支架組(55%)，且易于出現菌血癥(46%vs 21%，P＜0.05)，其中最常見的細菌為糞腸球菌(31%)，而無支架組膽道梗阻感染中最常見的細菌為大腸埃希桿菌(17%)。

支架植入后，在這些植入物的表面快速的覆蓋了1層宿主分泌的吸附蛋白，形成1層20～100A的蛋白吸附層，如纖維連接蛋白、層黏連蛋白、纖維素、膠原和免疫球蛋白［8］;纖維連接蛋白和玻璃黏連蛋白(S-蛋白)被認為是吸附在支架內表面主要的膽汁蛋白［9］;以這些物質表面為條件，使隨之進入膽道的細菌很容易黏附在材料表面。細菌表面的一些結構特點，如莢膜、鞭毛、菌毛和黏液在細菌的黏附中起著關鍵的作用;纖維蛋白、玻璃黏連蛋白和黏蛋白可促進細菌黏附于支架表面的過程，特別是細菌配體一旦遇到能與之結合的生物材料或吸附在材料表面上蛋白層中的受體上，則牢固地黏附在生物材料表面，完成黏附過程中受體與配體的結合，使黏附進一步加固，逐漸形成細菌生物膜，從而避免被人體吞噬細胞及大劑量抗生素的殺滅［10］;糞腸球菌和厭氧的產氣莢膜桿菌、梭狀芽孢桿菌產生一種葡萄糖醛酸苷酶，分解膽紅素加速膽汁沉渣的形成;同時細菌的磷脂酶C能水解膽汁中的卵磷脂，引起脂肪酸鈣鹽的沉積，從而導致了大量的不溶于水的物質形成并在膽管中沉淀，阻塞膽管［11］。

三氯生化學名稱 2，4，4’-三氯-2’-羥基二苯醚，易溶于多種有機溶劑及表面活性劑，但對強酸強堿及熱具有高度穩定性，且對常見致病性革蘭氏陽性陰性細菌、真菌、酵母及病毒等都具有廣泛的殺滅及抑制作用，從而日漸廣泛應用于醫療衛生領域;但在內置導管、支架方面沒有相關研究。三氯生主要通過抑制細菌脂肪酸合成系統中的一個關鍵酶-烯脂酰-酰基載體蛋白還原酶(ENR)的活性，阻止細菌合成脂肪酸［12］，從而抑制細菌細胞膜的形成和細菌的繁殖，由于人類沒有這個關鍵ENR酶，三氯生一直被認為對人體影響較小;本試驗結果證實低濃度的三氯生對糞腸球菌和大腸桿菌均顯示出有明顯的抑菌效果;這兩種細菌是膽道常見的致病菌，且分別代表了革蘭氏陽性球菌、革蘭氏陰性桿菌，說明該藥物在體外對常見細菌繁殖體具有較好的抗菌應用價值，且呈劑量依賴性，隨著劑量的降低，抑菌環逐漸減小;但與臨床常用于膽道系統抗生素鹽酸左氧氟沙星相比較，同等濃度下三氯生明顯優于左氧氟沙星抗菌效果，但在紫杉醇應用后，不同濃度下的三氯生抗菌效果均有所減弱，考慮為三氯生羥基鍵與紫杉醇形成化學鍵結合，影響了三氯生與細菌酶的結合，從而影響了抗菌效果。在膽汁浸泡環境下，三氯生的抗菌效果仍較為明顯，但材料表面的蛋白黏附仍較多，說明三氯生僅有抗菌效果，通過抑制細菌繁殖、減少黏附，使得膽汁中蛋白成分吸附于三氯生涂層的材料表面有所減少;但在體內膽道情況下三氯生效果需進一步研究，且課題組將進一步選用聯合協同抗蛋白黏附的藥物，延長膽道支架置入后通暢時間，逐步進行安全性實驗和動物實驗，以進一步減輕疾病癥狀、延長膽道再次梗阻時間。

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