紫斑牡丹胚培養及幼苗生長的研究

王 瑩，何桂梅，韓麗曉

（1.北京林業大學園林學院，北京 100083；2.北京市林業碳匯工作辦公室，北京 100013）

紫斑牡丹（Paeonia rockii T.Hong et J.J.Li）是中國牡丹家族中的重要成員之一，以其作為主要遺傳種質演化形成的西北（紫斑）牡丹品種群是目前中國牡丹中僅次于中原牡丹的第二大品種群[1]。紫斑牡丹植株長勢強盛、開花繁茂、花頭直立，具有抗寒、耐旱、抗病和耐瘠薄等優良特性[2]，是我國牡丹育種和遺傳改良極為珍貴的野生種質資源。自然栽培條件下紫斑牡丹屬于專性有性繁殖[3]，由于種子具有典型的上胚軸休眠現象導致其發芽率極低，幼苗質量不穩定[4]，在很大程度上制約了牡丹的繁殖及育種工作。

胚培養技術現已在植物遠緣雜交、克服頑拗種子休眠及發育生物學等研究方面得以廣泛應用，對提高種子萌發率、縮短萌發時間、及時進行雜種胚拯救、加速育種進程都有重要意義[5]。目前，牡丹胚培養研究主要包括不同基因型離體胚培養、叢生苗誘導及植株再生、生長調節劑對離體胚萌發及生長的影響[6-12]，而這些研究都沒能建立高效穩定的成苗體系，紫斑牡丹的胚培養也鮮有報道。筆者先研究紫斑牡丹胚離體生長與成苗過程中的影響因素，確定適宜的培養基；再選擇不同成熟度的種胚通過不同外植體類型進行試驗，摸索出紫斑牡丹胚培養最適宜的采種時間以及外植體類型，旨在建立穩定的紫斑牡丹胚培養體系，并為胚培養技術輔助遠緣雜交育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

以紫斑牡丹（P.rockii hybrid）自然授粉花后約90 d 與120 d 的紫斑牡丹種子為試驗材料（從北京林學會基地的健壯植株上采得）。外植體分為離體胚和帶胚乳兩種。試驗在北京林業大學科研樓組培室進行，培養條件：溫度20～25℃，光照強度為2 000～3 000 Lx，光照時間12 h/d。

1.2 試驗方法

1.2.1 消毒與接種 種子剝出后用洗滌靈溶液將其表面漂洗干凈，流水沖洗30 min 后置于超凈工作臺上。用70%酒精與10% 84 消毒液分別消毒種子3 min 與15 min。各次消毒后均用無菌水沖洗3次，每次浸泡3 min。接種于不同啟動培養基上，每瓶（100 mL）接種3 個，3 瓶為一個處理，重復3 次。

1.2.2 啟動培養基篩選 以1/2 MS 為基本培養基，附加不同濃度的PGRs（Plant growth regulators—植物生長調節劑），接種后35 d 調查種胚的萌發生長效果，篩選出最佳的啟動培養基。在此基礎上以1/2 MS+最適PGRs 為啟動培養基。每周定期觀察啟動生長表現，繼代周期35 d。

1.2.3 繼代培養基篩選 以1/2 MS+0.05% AC 為基本繼代培養基，附加不同濃度的IBA，將接種于附加不同濃度的PGRs 啟動培養基上的幼苗進行繼代，觀察繼代生長表現，從而篩選出最佳繼代培養基。在此基礎上以1/2 MS+0.05% AC+最適IBA為繼代培養基，分別將生長于1/2 MS+最適PGRs啟動培養基上的幼苗進行繼代，每周定期觀察繼代生長表現。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對紫斑牡丹種胚啟動生長的影響

以1/2 MS 為基本啟動培養基，通過PGRs 的不同種類及濃度的組合進行了啟動培養基的篩選，發現PGRs 的應用使得各培養基上幼胚的胚軸普遍膨大，部分長出大量的愈傷組織（表1）。其中在3號培養基中胚軸膨大率最高為100%，胚軸膨大率較高的3、6、7、8 號與其他培養基的差異顯著，胚軸膨大率較低的1、2、10 號三者之間沒有顯著差異，說明單一低濃度的BAP（0.5 mg/L）與GA3（0.5 mg/L）對胚軸的刺激作用不明顯，二者與低濃度IBA（0.25 mg/L）混合使用也有相似效果。在9 號和7 號培養基中抽腋芽或分化葉狀體率最高，除與1 號和6 號差異不顯著外，與其他培養基均有顯著差異。而在成苗率上5 號培養基為最高，與其余培養基差異顯著。綜合認為，1/2 MS+1.0 mg/L IAA+1.0 mg/L GA3（5 號培養基）為最適宜成苗的啟動培養基。

表1 培養基對紫斑牡丹種胚啟動生長的影響（35 d）

2.2 不同培養基對紫斑牡丹種胚繼代生長的影響

幼苗用3 水平的IBA（0.1、0.2、0.4 mg/L）進行10～15 d 短期根誘導后再繼代至不含PGRs 的培養基中，共培養85 d 統計結果（表2）。發現僅4 號的生根率及成苗率與其他的差異顯著，說明對于胚培養苗的繼代生長而言，不含PGRs 的1/2MS 培養基已經可以達到較好的效果，成苗率均可達到50%。另外發現IBA 根誘導處理后，低濃度的IBA（0.1、0.2 mg/L）對幼苗生長差異不顯著，高濃度的IBA（0.4 mg/L）反而抑制幼苗的生長。其中0.1 mg/L IBA 對幼苗的葉片數、生根率及成苗率等都有一定程度的提高，因此1/2 MS+0.05%AC+0.1 mg/L IBA為根誘導最佳培養基，1/2 MS+0.05% AC 為繼代生長最佳培養基。

2.3 紫斑牡丹采種時間及外植體類型對啟動生長的影響

以1/2MS+1.0 mg/L IAA+1.0 mg/L GA3為培養基，分別選擇紫斑牡丹花后90 d 和120 d 采收種子，按外植體類型分為離體胚和去種皮帶全部胚乳。研究表明（表3），從胚軸膨大率上可以看出，不論采收時間為何時，外植體為全部胚乳的表現明顯好于離體胚，并且它們之間差異顯著；從抽真葉率和抽莖率上可以看出，花后120 d 全部胚乳的處理最好，與其他處理間差異顯著；而從葉柄長可以看出，花后90 d 離體胚的處理最好，與其他處理間差異顯著。說明以全部胚乳為外植體對胚軸的膨大生長有一定作用，花后120 d 采收有助于種子的抽真葉與抽莖生長，而對于葉柄生長則以花后90 d 的離體胚處理效果最好。

表2 培養基對紫斑牡丹種胚繼代生長的影響（85 d）

2.4 紫斑牡丹采種時間及外植體類型對繼代生長的影響

表3 紫斑牡丹的不同處理在啟動培養基中的生長表現（30 d）

將啟動培養基中的幼苗以1/2 MS+0.05% AC+0.1 mg/L IBA 為根誘導培養基進行短期培養，之后轉入1/2 MS+0.05% AC 的繼代生長培養基中。從啟動培養到繼代培養共85 d，結果表明（表4），從抽真葉率和抽莖率上可以看出不論采收時間為何時，外植體為全部胚乳的表現好于離體胚，并且差異顯著；從葉柄長和莖長可以看出花后90 d 離體胚的處理生長要好于其他處理，并且在莖長上有顯著性差異。說明由于外植體類型的不同，會導致植株生長在不同指標上表現出差異性。帶全部胚乳的接種方式對抽真葉、抽莖等萌發生長有利，而離體胚的接種方式則對莖長、葉柄長等伸長生長有利。

表4 紫斑牡丹的不同處理在繼代培養基中的生長表現（85 d）

2.5 不同處理對紫斑牡丹胚培養幼苗生長的顯著性分析

在啟動培養階段（表5），研究發現采種時間的不同對真葉片數、抽莖率、葉柄長有顯著影響，其中對抽莖率有極顯著影響；外植體類型對抽真葉率、胚軸膨大率、葉柄長有顯著影響；其中對胚軸膨大率和葉柄長均有極顯著影響；而采種時間*接種方式兩者間的交互效應均對胚軸膨大率與葉柄長有顯著影響，其中對葉柄長有極顯著影響。

表5 紫斑牡丹的不同處理在啟動培養基中的生長顯著性分析（30 d）

在繼代生長階段（表6），采種時間的不同對真葉片數、葉柄長、莖長有顯著影響，其中對葉柄長有極顯著影響；外植體類型對抽真葉率及抽莖率有極顯著影響；而采種時間*接種方式兩者間的交互效應僅對莖長有顯著影響。

表6 紫斑牡丹的不同處理在繼代培養基中的生長顯著性分析（85 d）

綜合認為在紫斑牡丹胚培養過程中，種子的采收時間對真葉片數、葉柄長、莖長等指標影響顯著，說明種子成熟度的不同會影響幼苗的伸長生長；外植體類型對抽莖率、抽真葉率、胚軸膨大率等指標影響顯著，說明胚乳存在與否直接影響種子的萌發情況。

3 討 論

紫斑牡丹胚培養研究的目標是獲得高質量幼苗，而種胚能否正常啟動與啟動培養基的成分密切相關。研究結果表明，以1/2 MS 為基本培養基，附加不同濃度的PGRs，其中單獨使用BAP 可促進胚子葉增大、胚軸增粗，這與曹小勇[12]的觀察結果相似。GA3能解除部分胚軸的休眠，促進莖的伸長，單獨使用效果同BAP 相似，這與Buchheim[13]對芍藥的研究結果相符合。IAA 與GA31∶1 配合時抽真葉率、生根率及成苗率都較高，因此篩選出最適宜種胚啟動生長的培養基為1/2 MS+1.0 mg/L IAA+1.0 mg/L GA3。

目前牡丹組培快繁技術無法應用于生產的瓶頸主要在于組培苗生根困難，影響生根的因素主要包括前一次的繼代時間、生根芽的類型及生根方法等[14]。對幼苗短期的根誘導處理發現，IBA 的濃度直接影響幼苗的繼代生長情況，低濃度IBA（0.1 mg/L）可以促進幼苗生長，高濃度的IBA（0.4 mg/L）反而抑制幼苗生長，最適宜的根誘導培養基為1/2 MS+0.05%AC+0.1 mg/L IBA。研究還發現PGRs 對幼苗發育具有明顯的致畸作用，因此對于生根后幼苗生長的培養基選擇不含PGRs 的1/2 MS+0.05%AC。

紫斑牡丹為專性有性繁殖，實生苗一般需要3～5 a 才能開花，而從雜交授粉到一個優質新品種的選育過程至少需要10 a 以上的時間。在此過程中，由于種子具有上胚軸休眠特性，因此自然條件下其成熟與萌發也需要較長時間，并且萌發率與成苗率都不高，很難獲得整齊一致的幼苗。本研究在已篩選出最適宜培養基的基礎上，試圖通過種子成熟度以及外植體類型來找到既能使種子快速萌發又能提高成苗質量的有效途徑。雖然帶全部胚乳的種子在生長上沒有離體胚啟動快[15]，但是當全部胚乳接種長出胚根后，及時去掉胚乳再接回原培養基中，幼苗生長質量要優于離體胚的生長。由于紫斑牡丹胚乳中含有較高的還原糖及脂肪，為胚休眠、萌發提供了豐富的營養物質[16]，種子萌發也具有明顯的階段性，在萌發過程中，需要胚乳提供營養，一旦胚乳完成此功能需及時去掉，否則會抑制幼苗生長。種子采收時間的不同，直接影響種子的成熟度，這就與胚乳提供營養的情況密切相關，目前關于還原糖、淀粉、粗脂肪可能在種子各個萌發階段中的作用還不是很清楚，尚待進一步研究。

研究設計從啟動培養到繼代生長共85 d，獲得的幼苗絕大多數具有多片真葉及抽莖或已生根，提前了發育時期，縮短了種子的萌發期。因此，一個可靠的快繁體系可能克服牡丹在繁殖及育種方面的問題[17]，如果能將胚培養技術與牡丹遠緣雜交育種相結合，一定會大大縮短育種周期，提高育種效率，從而加快牡丹育種進程。

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