保加利亞乳桿菌利用α-亞麻酸合成共軛亞麻酸

郜 玉 婷, 葉 淑 紅, 王 際 輝, 陳 紅 州, 王 晗, 徐 龍 權

( 大連工業大學 食品學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

共軛亞麻酸(conjugated linolenic acid,CLN)具有極強的還原性,并且容易發生聚合反應,在生物體內可以被迅速氧化為活性更強的產物,從而具有了胞質毒性,特別是對惡性腫瘤細胞具有更強的殺傷作用[1],與共軛亞油酸(conjugated linoleic acid,CLA)作用相似,但與之相比具有更強的抗癌[2]、降血脂[3]、減肥[4]等生理作用,逐漸成為繼共軛亞油酸的又一研究熱點。

CLN的合成主要包括生物法、化學法和天然產物提取法三大類[5]。化學法可以大量合成CLN,易于工業化生產。然而通過化學法合成得到的多是CLN異構體的混合物,分離和純化比較困難,難以用于食品中。生物法具有選擇性合成、安全無毒害等優點,可以得到較高純度的CLN異構體,越來越受到關注,特別是經乳酸菌轉化獲得CLN逐漸興起[6]。但是,目前有關通過牛乳發酵產CLN的研究還無人涉及。

本試驗研究了保加利亞乳桿菌以脫脂乳為培養基,添加一定量α-亞麻酸,在特定條件下,菌體利用自身的亞油酸異構酶將α-亞麻酸轉化為CLN,并探討了不同因素對CLN產量的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

保加利亞乳桿菌,α-亞麻酸,高蛋白脫脂奶粉,其他試劑均為分析純;Spectrum one-B型紫外光譜儀,JASCD型高效液相色譜儀,D-37520型冷凍離心機。

1.2. 菌株的活化

用接菌環從平板上取菌株一環,接入含5 mL脫脂乳培養基的小試管中,在37 ℃下培養24 h。取經一次活化的脫脂乳培養基150 μL于含5 mL脫脂乳培養基的小試管中,在37 ℃下培養24 h。

1.3 α-亞麻酸的乳化

將Tween-80按培養基的0.1%,α-亞麻酸0.05%,加少量蒸餾水混合,在冰水浴下進行超聲波乳化分散。乳化超聲條件為:工作2 s、間歇5 s,超聲功率400 W,全程時間15 min。

1.4 發 酵

配制12%脫脂乳培養基30 mL,平均放入3個大試管中。菌株接種量3%,紫蘇油添加量0.6 mg/mL,在37 ℃下發酵培養48 h。

1.5 發酵產物中CLN的檢測

1.5.1 發酵產物中脂肪酸的提取

發酵結束后,將發酵產物移入離心管中,加入體積比為2∶1的氯仿甲醇混合液振蕩,冷凍離心(4 ℃,10 000 r/min,15 min),棄去上層水相,有機相中加入少量無水硫酸鈉脫去萃取液中的水分和水溶性物質,可消除水溶性物質對紫外的干擾。萃取液于旋轉蒸發儀30 ℃旋轉蒸發2～3 min,所得物質即為發酵產物中脂肪酸,用于檢測。

1.5.2 紫外光譜檢測

將一定量的樣品溶解到以正己烷有機溶劑的紫外區吸收為工作基線,在190～700 nm對配置的CLN正己烷溶液樣品進行掃描。

1.5.3 高效液相色譜分析[7]

1.6 發酵產物中CLN條件的優化

1.6.1 培養溫度對CLN生物合成的影響

將活化的菌株按照3.0%接種量接入到10 mL 脫脂乳發酵培養基,α-亞麻酸添加量為0.6 mg/mL,分別不同溫度下培養48 h。高效液相色譜測定試樣中CLN的生成量。

1.6.2 接種量對CLN生物合成的影響

改變菌株接種量,37 ℃培養,其他條件同“1.6.1”,測定CLN的生成量。

1.6.3 α-亞麻酸添加量對CLN生物合成的影響

改變α-亞麻酸添加量,其他試驗條件同“1.6.1”,測定CLN的生成量。

1.6.4 培養時間對CLN生物合成的影響

其他試驗條件同“1.6.1”,測定不同培養時間CLN的生成量。

1.6.5 正交試驗

根據單因素試驗結果,設置四因素三水平的正交試驗,并從中得到CLN發酵的最佳發酵條件(表1)。

表1 正交試驗L9(34)因素水平表

Tab.1 Concentration of variables and levels of orthogonal experiment

水平Aα-亞麻酸添加量/(mg·mL-1)Bθ/℃Ct/hD接種量/%10.331483.020.634725.030.937967.0

2 結果與討論

2.1 發酵產物中脂肪酸的紫外光譜檢測

與未發酵的脂肪酸紫外光譜圖(圖1)相比,發酵48 h的脂肪酸紫外光譜圖(圖2)在227 nm左右出現了明顯的特征峰,與Maria等[9]研究共軛三烯脂肪酸的紫外最大吸收一致,初步判定為CLN的特征吸收峰。

圖1 未發酵的脂肪酸紫外光譜圖

圖2 發酵48 h的紫外光譜圖

2.2 高效液相色譜法檢測CLN

CLN的保留時間在12 min左右(圖3),樣品經相同的液相色譜條件檢測,在12 min出現色譜峰(圖4)即為CLN色譜峰。根據歸一法對CLN進行定量分析,即溫度31 ℃、α-亞麻酸添加量0.6 mg/mL、接種量3.0%、發酵48 h時CLN產量為0.12 mg/mL。其他條件下CLN產量的測定同理。

圖3 CLN標準高效液相色譜圖

圖4 發酵產物中脂肪酸的高效液相色譜圖

2.3 脫脂乳發酵產CLN條件的優化

2.3.1 α-亞麻酸添加量對CLN產量的影響

由圖5可以看出,α-亞麻酸質量濃度在0.3～0.6 mg/mL,CLN生成量隨α-亞麻酸濃度增加逐漸增加,0.6 mg/mL時CLN產量達到最大；當α-亞麻酸濃度繼續升高,CLN生成量又逐漸下降,可能是高濃度的α-亞麻酸抑制了菌體的增長[1]。

圖5 α-亞麻酸添加量對CLN產量的影響

Fig.5 Effect of α-linolenic acid on CLN productivity

2.3.2 培養溫度對CLN產量的影響

乳酸菌轉化α-LA為CLN主要是亞油酸異構酶作用的結果[8],酶活性與溫度關系密切。由圖6可以看出,在34 ℃時CLN的生成量達到最高,隨著溫度的繼續升高,CLN的含量逐漸降低。原因是在一定溫度范圍內,溫度的升高使酶的活性增加,但隨著溫度的繼續升高會降低酶活,因此CLN生成量也隨之變化。

圖6 培養溫度對CLN產量的影響

2.3.3 培養時間對CLN產量的影響

由圖7可以看出,在0～72 h,CLN生成量與時間變化呈正相關,在72 h時達到最高。隨著時間繼續增加,CLN產量有所降低,可能由于CLN進一步被加氫、氧化形成其他脂肪酸[9]。

圖7 培養時間對CLN產量的影響

2.3.4 菌體接種量對CLN產量的影響

由圖8可以看出,菌體接種量為1.0%～5.0%,

圖8 菌體接種量對CLN產量的影響

隨著接種量增加,CLN產量逐漸增多,是由于菌體的增加使CLN產量增加,在接種量為5.0%時達到最高。隨著接種量繼續增加,CLN產量降低,可能是由于菌體濃度過大,菌體間相互競爭空間和培養基中的營養物質,導致菌體生長和繁殖受到抑制。

2.4 正交試驗結果分析

由表2可以看出,4個因素對CLN生成量的影響關系為C>B=A>D,即時間對指標的影響最顯著,溫度和α-亞麻酸添加量次之,菌體接種量的影響最小。綜合4個指標值可以看出,A2B1C1D2的CLN產量最高,說明此種組合對CLN增產效果最顯著,因此確定最優組合為A2B1C1D2(表3)。保加利亞乳桿菌的最佳發酵條件為:發酵溫度31 ℃,菌體接種量5.0%,α-亞麻酸添加量0.6 mg/mL,發酵時間48 h,在此發酵條件下CLN產量為0.15 mg/mL。

表2 CLN培養條件L9(34)正交試驗方案及結果

Tab.2 Designing and result of CLN incubation orthogonal test L9(34)

ABCDCLN生成量/(mg·mL-1)123456789K1K2K3k1k2k3R最優水平0.30.30.30.60.60.60.90.90.90.2400.3210.2700.0800.1070.0900.027A23134373134373134370.3210.2400.2700.1070.0800.0900.027B14872967296489648720.3390.2700.2190.1130.0900.0730.040C13577355730.2610.2910.2790.0870.0970.0930.010D20.110.070.060.120.070.130.090.100.08∑=0.83

表3 對照試驗結果

3 結 論

保加利亞乳桿菌以α-亞麻酸為底物發酵可以合成CLN,通過對培養條件進行優化,發酵溫度31 ℃、菌體接種量5.0%、α-亞麻酸添加量0.6 mg/mL、發酵時間48 h,CLN合成量達到0.15 mg/mL,達到目前國際水平,對于功能性乳制品的開發提供了理論依據。

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