普洱生茶快速發酵法制備茶褐素

房 賢 坤, 陳 杰, 姜 吉, 張 春 枝

( 1.大連工業大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034; 2.蒙頓茶制品(大連)有限公司, 遼寧 大連 116001 )

0 引 言

茶色素[1]作為一種天然食用色素,是由茶葉中以兒茶素為主的多酚類化合物氧化聚合衍生而來的一類水溶性色素混合物[2-3],根據顏色又可分為茶黃素(TFs)、茶紅素(TRs)、茶褐素(TBs)三類[4]?，F代藥理學研究表明,茶色素具有較強的抗氧化和清除自由基功能[6],在食品和醫藥領域存在潛在的開發價值。茶色素的研究主要集中在茶黃素和茶紅素上,而茶褐素是一類分子差異極大的化合物,由于其結構復雜,對茶褐素的研究進展緩慢,迄今為止,茶褐素的制備仍停留在過去單純地從普洱熟茶中提取,不僅含量低,而且由于普洱熟茶價格昂貴,對茶褐素的制備和應用造成了極大限制。

普洱茶渥堆發酵是茶褐素形成的關鍵工序,在微生物分泌的胞外酶的作用下,普洱茶中以茶多酚為主體的多種成分發生一系列復雜而劇烈的化學變化,形成了普洱茶特有的色香味品質,同時伴有茶褐素的大量生成[5-6]。作者從普洱茶渥堆發酵眾多微生物中篩選到一株霉菌fxk-01,并對其發酵條件進行了研究,重點研究了發酵后普洱生茶中茶褐素的提取條件,測定了茶褐素樣品的抗氧化能力,以期為茶褐素的實際生產和利用提供必要的理論參考。

1 試 驗

1.1 材料與菌種

普洱生茶,產地云南普洱；霉菌fxk-01,普洱茶渥堆發酵樣品中篩選得到。

1.2 方 法

1.2.1 種子液的制備

培養基的制備:硝酸鈉2 g,磷酸氫二鉀1 g,氯化鉀0.5 g,硫酸鎂0.5 g,硫酸鐵0.01 g,蔗糖30 g,水1 000 mL,將上述各成分依次溶解,待完全溶化后,補足水分到所需體積,將培養基分裝于250 mL燒瓶內,在121 ℃、0.1 MPa高溫高壓滅菌20 min。

在無菌條件下,將已滅過菌的培養基中接入霉菌fxk-01,在28～30 ℃、160 r/min搖床培養7 d。

1.2.2 發酵條件的選擇

分別考察發酵時間、發酵溫度對茶褐素產量的影響。發酵時間分別為5、6、7、8、9、10、11 d,發酵溫度為25、30、35、40、45、50 ℃,發酵完成后測其中茶褐素含量[9],確定最適發酵條件。

1.2.3 提取條件的優化

以最優發酵后茶葉為對象,以茶褐素相對含量為測量指標,對茶褐素進行有機溶劑萃取,對提取過程中提取次數、提取溫度、料液比、提取時間分別進行單因素試驗和正交試驗,確定最優提取條件,提高茶褐素得率。

1.2.4 茶褐素抗氧化活性的測定

對制得的茶褐素樣品進行清除DPPH自由基能力的測定[10],確定茶褐素樣品的抗氧化活性。

2 結果與討論

2.1 最適發酵時間的選擇

稱取普洱生茶10 g,加去離子水10 mL潤濕,經100 ℃沸水滅菌30 min,冷卻后在無菌室接種霉菌fxk-01,在30 ℃培養箱中培養發酵,每天搖瓶1次,從第5天開始測其中茶褐素的含量,確定最優發酵時間。結果如圖1所示,發酵到第8天后茶褐素含量最大并基本不變,因此最佳發酵時間為8 d。

2.2 最適發酵溫度的選擇

稱取普洱生茶10 g,加去離子水10 mL潤濕,經100 ℃沸水滅菌30 min,冷卻后在無菌室接種霉菌fxk-01,分別在25、30、35、40、45、50 ℃培養箱下發酵8 d,測定茶褐素質量分數,確定最優發酵溫度。結果如圖2所示,35 ℃發酵條件下能生成最高含量的茶褐素,故最佳發酵溫度為35 ℃。

圖1 不同發酵時間的發酵結果

Fig.1 Result of fermentation on different fermentation time

圖2 不同發酵溫度的發酵結果

Fig.2 Result of fermentation on different fermentation temperature

2.3 發酵前后茶色素含量的變化

根據發酵條件優化的結果,稱取普洱生茶10 g,加10 mL去離子水潤濕,經100 ℃沸水滅菌30 min后,于無菌室接種霉菌fxk-01,接種量為5%,在35 ℃培養箱中培養發酵8 d后測茶色素質量分數。結果見表1,普洱生茶發酵前后茶紅素和茶黃素質量分數分別降低了73.35%和66.84%,茶褐素含量提高了8.23倍,原因是茶紅素和茶黃素包括其前體茶多酚在微生物分泌的酶的作用下進一步氧化縮合生成了茶褐素,造成茶褐素含量大幅升高。

表1 茶葉發酵前后茶色素質量分數的變化

2.4 提取條件的單因素試驗

2.4.1 提取次數的優化

選用水為提取溶劑,稱取發酵后普洱生茶10 g,按料液比1∶10,100 ℃沸水提取20 min,茶湯經過濾、冷卻至室溫后用等體積正丁醇萃取3 min,取下層水溶液稀釋80倍,以水做空白,于380 nm處測OD值,共提取3次。試驗結果如圖3所示,普洱生茶在提取2次后茶褐素含量下降明顯,考慮試驗原料和后續的處理工作,合理的提取次數為2次。

圖3 普洱生茶不同提取次數提取的結果

Fig.3 Result of extraction of pu′er tea with different extracting times

2.4.2 提取溫度的優化

稱取發酵后普洱生茶10 g,提取溶劑為水,料液比1∶10,提取時間20 min,提取2次,僅改變提取溫度,分別為70、80、90、100 ℃。茶湯減壓濃縮干燥后茶粉用100 mL去離子水溶解,等體積正丁醇萃取3 min,取下層水溶液1 mL稀釋80倍,以水做空白,在380 nm處測OD值。結果如圖4所示,80 ℃以后茶褐素提取率相差不大,因此考慮到生產成本和生產安全,最優的提取溫度為80 ℃。

圖4 不同提取溫度的提取結果

2.4.3 提取時間的優化

稱取發酵后普洱生茶10 g,提取溶劑為水,料液比1∶10,提取溫度80 ℃,提取2次,僅改變提取時間,分別為10、20、30、40 min進行試驗。茶湯減壓濃縮干燥后茶粉用100 mL去離子水溶解,等體積正丁醇萃取3 min,取下層水溶液1 mL稀釋80倍,以水做空白,在380 nm處測OD值。試驗結果如圖5所示,提取時間從10 min到30 min 時,茶褐素的提取率不斷增大,超過30 min 繼續提取,提取率基本不變。故采用提取時間為30 min。

圖5 不同提取時間提取的結果

2.4.4 料液比的優化

稱取發酵后普洱生茶10 g,提取溶劑為水,采用提取溫度80 ℃提取30 min,共提取2次,僅改變料液比,分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40。茶湯經減壓濃縮干燥后茶粉用100 mL去離子水溶解,等體積正丁醇萃取3 min,取下層水溶液1 mL 稀釋80倍,以水做空白,在380 nm處測OD值。試驗結果如圖6所示,當料液比低于1∶30時,隨著料液比的增加,茶褐素的提取率明顯增高,當料液比1∶40時增幅較小。又因為過高的料液比會給后續一些工作如過濾、濃縮等帶來麻煩,故最佳的料液比選擇1∶30。

圖6 不同料液比提取的結果

Fig.6 Result of extraction with different ratio of material and liquid

在最優發酵條件下發酵普洱生茶,并在最佳提取條件下提取過濾后獲得茶湯,將茶湯經乙酸乙酯萃取2次,每次萃取5 min,除掉茶黃素；取下層用氯仿萃取3次,每次5 min,除去咖啡堿；取水層再用正丁醇萃取2次,每次萃取3 min,除去茶黃素和茶紅素,水層減壓濃縮后烘干至固體,樣品得率約為10%,分光光度法測得其中茶褐素質量分數為826.4 mg/g。

2.5 提取條件的正交試驗

為進一步優化提取條件,在單因素試驗的基礎上,選取次數、溫度、時間、料液比這4個因素做四因素三水平正交試驗,結果見表2、3。

表2 茶褐素提取條件正交試驗結果

Tab.2 Result of orthotropic test about extraction conditions of TBs

因素次數θ/℃t/min料液比OD值試驗111(75)1(25)1(1∶25)0.71試驗212(80)2(30)2(1∶30)0.84試驗313(85)3(35)3(1∶35)0.82試驗421(75)2(30)3(1∶35)0.89試驗522(80)3(35)2(1∶30)0.98試驗623(85)1(25)1(1∶25)0.91試驗731(75)3(35)2(1∶30)0.78試驗832(80)1(25)3(1∶35)0.86試驗933(85)2(30)1(1∶25)0.88均值10.7900.7930.8270.857均值20.9270.8930.8700.843均值30.8400.8700.8600.857極差0.1370.1000.0430.014

表3 茶褐素提取條件方差分析

Tab.3 Analysis of variance aboat extraction conditions of TBs

因素偏差平方和自由度F比F臨界值顯著性次數0.02929.6679.000*溫度0.01625.3339.000時間0.00321.0009.000料液比0209.000誤差02注:F0.1(2,2)=9.00。

通過正交方差表分析可以看出,各因素影響的重要性為次數、溫度、時間、料液比,且次數對結果影響顯著,溫度和時間影響不顯著,所以普洱生茶茶褐素的最佳提取條件為:提取溫度為80 ℃,提取時間35 min,提取次數為2次,料液比為1∶30。

2.6 DPPH自由基的清除能力

以VC為陽性對照,測定茶褐素對DPPH自由基的清除能力,結果如圖7所示,在所測濃度范圍內,相同濃度茶褐素的清除DPPH自由基能力強于VC。當質量濃度為50 μg/mL時,茶褐素提取物清除率達94.12%,并隨著茶褐素提取物濃度的增加,清除能力增強。由此可見,茶褐素提取物對DPPH自由基有很強的清除能力。

圖7 茶褐素與VC清除DPPH自由基能力的比較

Fig.7 Comparison on DPPH radical scavenging capacity of the extract from TBs and VC

3 結 論

(1)以普洱生茶為原料進行發酵的最優條件為:發酵溫度35 ℃,發酵時間8 d,發酵完成后茶褐素含量較未發酵普洱生茶提高了8.23倍。

(2)普洱生茶茶褐素的最佳提取條件為:提取溫度為80 ℃,提取時間35 min,提取次數為2次,料液比為1∶30。

(3)在所測濃度范圍內,相同濃度茶褐素提取物的清除DPPH自由基的能力高于VC,且隨著提取物濃度的增加而增強,這說明茶褐素提取物有很強的抗氧化活性。

[1] 呂虎,孔慶友,冷和平,等. 茶色素制取及化學組成[J]. 林產化學與工業, 2000, 20(4):63-66.

[2] 程啟坤. 紅茶色素的系統分析方法[J]. 中國茶葉, 1981(1):24-30.

[3] BAILEY R G, NURSTEN H E, DOWELL I. Isolation and analysis of a polymeric thearubigin fraction from tea[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1992, 59:365-375.

[4] SARKAR A, BHADURI A. Black tea is a powerful chemopreventor of reactive oxygen and nitrogen species: comparison with its individual catechin constituents and green tea[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2001, 284(1):173-178.

[5] 蕭偉祥,鐘瑾,蕭慧,等. 茶色素形成機理與制取[J]. 茶葉科學, 1997, 17(1):1-8.

[6] 蕭偉祥,鐘瑾,蕭慧,等. 制茶發酵中茶色素形成生化機理[J]. 福建茶葉, 1998(3):8-12.

[7] 黃意歡. 茶學實驗技術[M]. 北京:中國農業出版社, 1995:51-53.

[8] 王會,郭立,謝文磊. 抗氧化劑抗氧化活性的測定方法[J]. 食品與發酵工業, 2006, 32(3):92-98.