仿刺參體表微生物的菌相分析

成 功, 裴 贏 瑩, 張 公 亮, 侯 紅 漫

( 大連工業大學 食品學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

仿刺參(Apostichopusjaponicus)作為餐桌上的佳肴早已聞名遐邇。2003年,我國海參的總產量只有3.9萬t左右,2008年已經達到了9萬t,經濟總產值超過200億元。但是,隨著海參養殖量的增加,海區的養殖壓力加大,海水污染嚴重,加上海參本身的水分、蛋白質含量高,是一種很好的培養基,使得海參體內外含有豐富的微生物類群,甚至存在著多種致病菌[1]。因此,近年來頻繁出現“腐皮綜合癥”,導致海參大批量死亡[2]。

目前,國內外對海參微生物菌群的研究還不夠系統,特別是海參體表微生物的組成更是少有報道。孫奕等[3]從刺參前后消化管、體腔液和表皮上分離到359株細菌分別屬于弧菌屬、假單胞菌屬、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)、不動桿菌屬、柄桿菌屬(Caulobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、節桿菌屬(Arthrobacter)、微球菌屬(Micrococcus)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、產堿菌屬(Alcaligenes)這11個主要菌屬。向怡卉等[4]對大連產海參(仿刺參)不同部位的細菌進行了分離鑒定,得到3種菌株,分別為Kocuriaroseastackebrandt、棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)和有毒威克斯菌(WeeksellaviroseHolmes),其中有毒威克斯菌是一種致病菌,其余兩種為優勢菌。

本實驗對大連冬、春兩季海參體表微生物進行分離培養,同時結合表型鑒定和分子遺傳學鑒定的方法對未知菌進行準確定位,較為系統地分析了海參體表的微生物菌群,為海參病害原因分析、防治以及海參生產加工提供一定的參考依據。

1 實 驗

1.1 材 料

2009年11月23日和2010年3月5日從大連長興鮮活海產品市場購買質量約為200 g的大連仿刺參,在運輸過程中加養殖所用海水,并且充氧以保持樣品的鮮活狀態,30 min內運至實驗室。用滅菌生理鹽水沖洗數遍,無菌條件下剪取各部分體表樣品。

1.2 樣品處理

稱取10 g體表樣品加入90 mL無菌生理鹽水,用滅菌勻漿器充分研磨均勻后,以10倍遞增稀釋法進行稀釋,取3個合適的稀釋度涂布于2216培養基[5]、葡萄糖瓊脂培養基和TCBS培養基[6]。每個稀釋度做3個平行,25 ℃培養48 h。

1.3 細菌的分離純化

挑選菌落數在30～300個的平板,綜合菌落形態和細胞形態分離純化所有菌株。

1.4 細菌的鑒定

1.4.1 細菌的形態和理化特性檢測

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》。對分離純化的菌株作革蘭氏染色,在光學顯微鏡下觀察細菌形態,然后進行生理生化特性測定,并作初步鑒定和常規分類。

1.4.2 模板制備及16S rDNA的PCR擴增

將初步鑒定分類好的細菌接種于相應的液體培養基,25 ℃,150 r/min過夜培養后,按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取細菌DNA,作為PCR反應的DNA模板。PCR擴增引物為通用引物27f和1492r,PCR擴增條件:94 ℃ 5 min,30個循環(94 ℃ 60 s；60 ℃ 40 s；72 ℃ 90 s),72 ℃續延伸10 min。PCR擴增產物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.3 16S rDNA序列分析

PCR擴增產物送至測序公司測序。將測序結果在NCBI網站中利用Blast軟件在GenBank數據庫中進行相似性比較,選取同源性較高的相關菌株的16S rDNA序列作為參比對象,用Clustal X軟件按照最大同源性的原則進行多序列比對。

1.4.4 構建系統進化樹

采用MEGA4.0軟件依據鄰位相連法對所有分離鑒定菌株的16S rDNA序列與GenBank數據庫中序列進行分析比較,繪出系統進化樹。

2 結果與討論

2.1 細菌的分離與培養

挑取稀釋度為10-3的樣品分別涂布于3種培養基,不同培養基獲得的菌落數量有明顯的差異,對3種培養基進行菌落計數,結果如表1所示。

表1 仿刺參體表菌群的數量

Tab.1 The quantity of the surface microflora ofApostichopusjaponicus

組別c/(μmol·L-1)t/h244872A值抑制率/%A值抑制率/%A值抑制率/%對照組01.414±0.0041.376±0.0221.192±0.008實驗組1001.128±0.003a20.251.015±0.001a26.220.791±0.003a33.651500.874±0.003a38.190.815±0.003a40.750.604±0.003a49.262000.642±0.000 6a54.620.534±0.002a61.170.420±0.003a64.782500.513±0.006a63.720.405±0.008a70.600.283±0.002a76.253000.317±0.003a77.600.273±0.003a80.160.072±0.007a93.98注:a表示差異P<0.05。

2.2 生理生化反應

從仿刺參體表分離得到的菌株經革蘭氏染色后,鏡檢觀察菌體形態和菌落形態,根據鏡檢結果將其劃分為10組,然后對這10組菌做常規生理生化實驗,結果如表2所示。

表2 細菌生理生化結果

Tab.2 The results of bacterial physiological and biochemical analysis

組別12345678910形狀rrrrrc/rrrrc革蘭氏染色-------+++運動性+++++--++-接觸酶-++++-++++氧化酶++++-+----葡萄糖產酸+--+++++++葡萄糖產氣----------吲哚------+--+明膠液化+-++++-++-檸檬酸鹽-+----++--注:r為桿菌,c/r為球桿菌,c為球菌;“+”代表陽性反應;“-”代表陰性反應。

2.3 菌株16S rDNA的PCR擴增

將菌株的PCR擴增產物通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳,得到PCR擴增產物的大小1 500 bp左右,凝膠電泳圖如圖1所示。圖1中的目的條帶大小為1 500 bp,為各菌株的16S rDNA,之后將各菌株的PCR擴增產物送至測序公司測序。

圖1 菌株PCR產物凝膠電泳圖

2.4 菌株16S rDNA的同源性比對

將測定菌株的16S rDNA的序列在GenBank數據庫中,與GenBank數據庫中已知16S rDNA序列相似性最高為100%,最低為97%。結果表明,從大連地區仿刺參體表分離得到的細菌分屬于10個菌,分別為交替假單胞菌屬、希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬、枯草芽孢桿菌、變形菌屬、Alteromonadaceas、不動桿菌屬、解淀粉芽孢桿菌、腐生葡萄球菌。仿刺參體表細菌的菌相組成如表3所示。

2.5 仿刺參體表可培養細菌的系統發育學分析

仿刺參體表細菌的系統進化樹分析表明,所得到的19條有效序列中交替假單胞菌屬(Pseudoalteromonas)和弧菌屬(vibrio)同屬于γ-變形菌綱；變形桿菌屬(Proteobacterium)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloiquefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)同源關系較近；Bacillussubtilis(AY881647.1)與Vibrio-cyclitrophicus(AM422804.1)同源關系較近。仿刺參體表細菌的系統進化樹如圖2所示。

圖2 仿刺參體表細菌系統進化樹

Tab.3 The composition of bacterial flora on the surface ofApostichopusjaponicus

組別細菌冬季海參春季海參綜合菌株數/個所占比例/%菌株數/個所占比例/%菌株數/個所占比例/%革蘭氏陰性菌5484.33278.18681.91交替假單胞菌屬1828.1819.52623.82弧菌屬1320.31024.62422.93希瓦氏菌屬1117.2717.11817.14假單胞菌屬46.212.454.85變形菌屬34.712.443.86Alteromonadaceas——24.821.97不動桿菌屬57.837.387.6革蘭氏陽性菌1015.7921.91918.18枯草芽孢桿菌69.337.398.69解淀粉芽孢桿菌46.424.865.710腐生葡萄球菌——49.843.8總計6410041100105100注:“—”代表未檢測出。

3 討 論

本研究表明,從大連仿刺參體表分離得到的細菌中的假單胞菌屬、弧菌屬、不動桿菌屬、芽孢桿菌屬為海水中主要的細菌[7-8],說明這些細菌很可能是附生在仿刺參體表的。從仿刺參中分離得到大量的交替假單胞菌,交替假單胞菌是海洋底部泥土中一種非常常見和重要的細菌,是一種條件致病菌,在海帶、海藻、魚類、貝類等海洋生物體內都有分布,它的營養要求低,能生活在各種環境中。交替假單胞菌能產生內毒素、脂酶、卵磷脂酶、蛋白酶及外毒素等,這些物質很多與致病性有關。仿刺參體表中分離出大量該菌種,很可能與仿刺參的生活習性有關。目前關于交替假單胞菌的致病性研究和關于其性質的報道比較少,孟慶國等[9]在國內外首次報道交替假單胞菌是養殖刺參潰瘍性的病原菌。

腐敗和致病菌是危害水產品細菌學研究的兩個主要方面,其中對腐敗菌的研究更為普遍。假單胞菌和希瓦氏菌為常見優勢腐敗菌,特別是在水產品的冷卻鏈過程中假單胞菌和希瓦氏菌為鮮活水產品的特定腐敗菌[10]。本實驗在冬春兩季的海參體表均分離出一定數量的希瓦氏菌和假單胞菌,因而建議盡可能縮短海參加工前的冷藏過程。

許多報告指出,在自然環境中有相當多的菌種(約90%～99%)用傳統的純培養方法無法培養出來[11]；并且利用傳統技術對微生物菌群進行培養時,會不可避免地造成菌株的富集或衰減,對結果造成偏差。如果將傳統的純培養技術和非培養技術結合使用,則可以相輔相成,更全面地反映復雜環境中微生物群落的種類。

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