丹酚酸A對牛血清白蛋白的熒光猝滅作用

張 曦, 寇 自 農, 石 羽 佳, 朱 靖 博,3

( 1.大連工業大學 食品學院, 遼寧 大連 116034; 2.大連工業大學 分析測試中心, 遼寧 大連 116034; 3.大連工業大學 植物資源化學與應用研究所, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

蛋白質與其他物質發生相互作用時,蛋白質的熒光強度也會發生改變,這一變化是表征二者相互作用非常有效的方法?，F有利用熒光光譜法研究小分子藥物如秋水仙堿、Indo-1、蘆丁等[1-3]與血清白蛋白相互作用的報道,然而未見文獻報道研究丹酚酸A與血清白蛋白之間的相互作用。作為載體蛋白,其在血漿中含量豐富,能和許多內源小分子以及外源性物質廣泛結合,在配體的傳輸和存儲過程中起著十分重要的作用。因此研究丹酚酸A與血清白蛋白相互作用的信息對深入研究丹酚酸A的作用機制奠定了理論基礎。

本實驗在生理pH條件下研究丹酚酸A與牛血清白蛋白之間的相互作用,根據熒光猝滅光譜計算兩者的結合常數和結合位點數,并判斷它們之間的主要作用力類型。

1 材料與方法

1.1 試 劑

BSA用pH=7.4的Tris-HC1緩沖溶液配制成5×10-5mol/L的母液,4 ℃低溫保存備用；丹酚酸A標準品,現用現配,工作液配制為梯度濃度；實驗用水為超純水,其他試劑均為分析純。

1.2 方 法

10 mL比色管中,依次加入0.5 mL 5×10-5mol/L 的BSA溶液和1.0 mL一定濃度的丹酚酸A溶液,超純水定容至4 mL,混合均勻。在熒光光譜實驗中,移取一定量該混合溶液于石英熒光池中。以280 nm為激發波長,設置激發狹縫寬度為7.0 nm,發射狹縫寬度為7.0 nm,掃描速率為600 nm/min,分別在25、30、35 ℃下測定288～488 nm的熒光發射光譜。

2 結果與討論

2.1 丹酚酸A對BSA熒光光譜的影響

BSA分子包含色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸3種氨基酸殘基,能夠產生不同的熒光光譜,其熒光發射峰(λmax)分別位于348、303和282 nm。設定波長在280 nm時,BSA熒光發射峰位于340 nm附近。當BSA溶液濃度一定時,向其中加入不同濃度的丹酚酸A。結果如圖1所示。

1～7,丹酚酸A濃度分別為2.27×10-6、4.53×10-6、9.06×10-6、1.36×10-5、1.81×10-5、2.27×10-5mol/L；BSA濃度為6.25×10-6mol/L

圖1 不同濃度丹酚酸A與BSA作用的熒光發射光譜

Fig.1 The fluorescence emission spectrum of interaction between Sal A and BSA

隨著丹酚酸A濃度的增加,BSA內源熒光強度規律性地降低,最大發射峰波長及峰形變化不大,這說明丹酚酸A對BSA有猝滅作用。

2.2 丹酚酸A對BSA的熒光猝滅機理

靜態猝滅和動態猝滅是熒光淬滅的兩種基本類型[4]。假設丹酚酸A對BSA的猝滅屬于分子碰撞引起的動態猝滅,應符合Stern-Volmer方程[5]

F0/F=1+kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式(1)中,F0為未加猝滅劑時BSA的熒光強度；F為加入猝滅劑后BSA的熒光強度；[Q]為猝滅劑丹酚酸A的濃度；τ0為無猝滅劑時BSA作為熒光分子的平均壽命,對BSA來說,其τ0約為6.2 ns[6]；kq為熒光猝滅的速率常數；KSV為Stern-Volmer方程的猝滅常數,

ΚSV=kqτ0

(2)

若丹酚酸A對BSA的猝滅過程為靜態猝滅,則應符合Lineweaver-Burk方程[5]

(3)

式(3)中,K為丹酚酸A與BSA的結合常數。不同溫度下丹酚酸A對BSA熒光猝滅光譜,可由Stern-Volmer方程得到,結果如圖2所示。由圖2可看出,分別在25、30、35 ℃時F0/F-[Q]線性較差,溫度對圖線影響較小。根據不同溫度下蛋白質熒光猝滅光譜,得到(F0-F)-1-[Q]-1的雙倒數Lineweaver-Burk圖,結果如圖3所示。由圖3則可看出,分別在25、30、35 ℃時(F0-F)-1-[Q]-1線性關系良好,不同溫度下圖線斜率變化顯著。

圖2 丹酚酸A對BSA的Stern-Volmer圖

圖3 丹酚酸A對BSA的Lineweaver-Burk圖

由圖2、3及公式(1)～(3)得出不同溫度下丹酚酸A與BSA相互作用參數KSV、kq和K(見表1)。

表1 丹酚酸A與BSA不同溫度下相互作用常數

Tab.1 Interaction constants of Sal A and BSA at different temperatures

θ/℃KSV/(L·mol-1)kq/(L·mol-1·s-1)K/(L·mol-1)r21r22251.78×1052.87×10141.49×1050.999 30.986 2301.86×1053.00×10141.19×1050.995 60.979 5351.63×1052.63×10148.24×1040.992 20.993 1注:r1、r2分別為Lineweaver-Burk和Stern-Volmer方程的相關系數。

由表1可以看出,提高環境溫度并未表現出對Stern-Volmer直線斜率有所影響。而在動態猝滅過程中,各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅速率常數為2.0×1010L/(mol·s)[2]。顯然,丹酚酸A對BSA的熒光猝滅速率遠大于最大擴散碰撞猝滅速率常數。而提高環境溫度使Lineweaver-Burk直線斜率增大,這是由于提高環境溫度使丹酚酸A與BSA復合物的穩定性有所下降。由以上判斷,丹酚酸A對BSA的相互作用由于形成了復合物而引起了BSA的內源熒光的熒光猝滅,屬于靜態猝滅范疇。

2.3 熱力學性質

根據藥物與蛋白質作用前后焓變ΔH和熵變ΔS判斷二者間的主要作用力。由方程式(4)、(5)可分別計算出ΔH、ΔG和ΔS。在實驗溫度變化范圍內,ΔH隨溫度的改變忽略不計。

ln(K2/K2)=ΔH(1/T1-1/T2)/R

(4)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK

(5)

由公式(4)、(5)可求得丹酚酸A與BSA結合的熱力學參數,結果見表2。

表2 丹酚酸A與BSA相互作用的熱力學參數

Tab.2 Thermodynamic parameters of interaction of Sal A and BSA

T/KΔH/(kJ·mol-1)ΔS/(J·mol-1·K-1)ΔG/(kJ·mol-1)298-56.55-90.74-29.51303-56.55-89.47-29.44308-56.55-89.51-28.98

當ΔS>0,ΔH>0為典型的疏水作用力；ΔH<0,ΔS<0為氫鍵和范德華力；當ΔH<0,ΔS>0時,主要存在靜電相互作用。由表2可見,ΔG<0,表明丹酚酸A與BSA的作用是一自發過程,ΔH<0,ΔS<0,表明丹酚酸A與BSA之間的作用力主要是氫鍵和范德華作用力。

2.4 丹酚酸A與BSA的結合位點數

由于丹酚酸A與BSA之間屬于生成復合物的靜態猝滅,假設BSA有n個相同且獨立的結合位點可與丹酚酸A結合。如nQ+M→QnM。式中M為BSA分子；Q為丹酚酸A分子；QnM為復合物,生成常數為K。若BSA總濃度[M0]=[QnM]+[M]([M]為游離BSA濃度), 則有[QnM]=[M0]-[M]。

lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[Q]

(6)

通過其斜率和截距計算得丹酚酸A與BSA的結合位點數n為1.158。

3 結 論

丹酚酸A與BSA的相互作用使BSA內源熒光規律性猝滅,猝滅機理為靜態猝滅,形成了復合物,結合常數較大,丹酚酸A與BSA之間主要由氫鍵和范德華作用力維系。25、30、35 ℃時丹酚酸A與BSA反應的結合常數分別為1.49×105、1.19×105、8.24×104L/mol,焓變ΔH=-56.55 kJ/mol。結合位點數為1.158,說明BSA可以攜帶丹酚酸A在體內進行運輸、代謝和分配。對丹酚酸A與BSA相互作用以其他監測手段的新方法有待于進一步深入研究。

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