絞股藍皂苷糖苷酶的分離純化及酶性質的研究

毛 澤 仁, 張 景, 金 鳳 燮, 魚 紅 閃

( 1.大連工業大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034; 2.大連市產品質量監督檢驗所, 遼寧 大連 116021 )

0 引 言

絞股藍中含有多種化學成分[1-2],其中以絞股藍皂苷為主要的藥理活性成分。絞股藍皂苷(Gypenosides)是絞股藍全草的有效成分,具有多種醫療保健功能[3]。自然界中絞股藍皂苷多是由絞股藍皂苷元與葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、木糖及阿拉伯糖等糖基連接而成,這種結構不是其生物活性的最佳狀態,若將其轉化為低糖基皂苷或皂苷元,它的生物活性有可能會得到提高。

本實驗室前期篩選出的Absidiasp. GYP4r菌,能夠產生一種可將絞股藍皂苷水解為低糖基絞股藍皂苷的酶[4],該酶有可能提高絞股藍皂苷的生物活性。本實驗對絞股藍皂苷糖苷酶的分離純化及性質進行了研究,為今后絞股藍皂苷糖苷酶的分子生物學性質進一步研究提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗菌種Absidiasp.GYP4r,由大連工業大學菌種保藏所提供；絞股藍皂苷；人參皂苷標準品，實驗室自制；薄層層析板,德國Merk公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 培養基的制備

斜面培養基的制備:準確稱取硝酸鈉3.0 g,磷酸二氫鈉1.0 g,七水合硫酸鎂0.5 g,氯化鉀0.5 g,硫酸鉀0.5 g,硫酸亞鐵0.01 g,蔗糖30.0 g,瓊脂15 g,用去離子水定容至1 000 mL,121 ℃濕熱滅菌后備用。

擴大培養基的制備:稱取麥麩16.0 g,槐花4.0 g(作為誘導物),溶于20 mL去離子水中,121 ℃ 濕熱滅菌后待用。

1.2.2 菌種的培養及粗酶液的提取

將菌種接種于已滅菌的斜面培養基中,在30 ℃的恒溫箱中培養6～7 d,活化后的菌放于冰箱內保存。將斜面菌種接種于已滅菌的擴大培養基中,仍在30 ℃的恒溫箱中培養6～7 d。待菌長好后將培養基浸泡于100 mL 0.02 mol/L pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液中2 h,邊浸泡邊攪拌,然后將浸泡液過濾。濾液用高速冷凍離心機在8 000 r/min下離心15 min,收集上清液,在磁力攪拌的條件下,緩慢加入已研磨好的硫酸銨粉末至75%飽和度,4 ℃下靜置1～2 h。再用高速冷凍離心機在13 000 r/min下離心20 min,棄上清,收集蛋白質沉淀。沉淀用10 mL 0.02 mol/L pH 5.0 醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解,裝入透析袋,用相同的緩沖液透析24 h,約每2 h 更換一次緩沖液。透析結束后,用高速冷凍離心機在13 000 r/min下離心10 min,除去不溶性雜蛋白。所得上清液即為粗酶液,將酶液放于冰箱中保存。

1.2.3 酶活力的測定

取1 mg絞股藍皂苷,加0.2 mL 95%的乙醇和0.8 mL的0.02 mol/L pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液將其溶解,配制成底物,取0.1 mL的底物與0.1 mL的酶液混合,40 ℃下反應24 h,然后加入0.2 mL水飽和正丁醇終止反應,振蕩分層后取上層作薄層層析(TLC)分析。展開劑V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5；顯色劑為10%的濃硫酸。

1.2.4 粗酶液的純化

用0.5 mol/L的NaOH和0.5 mol/L的HCl反復處理DEAE-cellulose DE52陰離子交換柱,再用0.02 mol/L pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡后,向柱子中加入8 mL酶液,然后用60、90、120、180、240、300、400、500、600 mmol/L的KCl梯度洗脫,自動部分收集器以3 min/管的速度收集洗脫液,洗脫液經紫外檢測儀在280 nm 下跟蹤測定各點的OD值,并通過蛋白質色譜儀繪出吸收圖譜。收集各峰值管的酶液,TLC檢測酶活力。

1.2.5 酶的分子質量測定

將純化后的酶溶液經三氯乙酸沉淀,丙酮洗滌后,再用醋酸-醋酸鈉緩沖液和上樣緩沖液溶解,然后進行SDS-PAGE凝膠電泳,最終得到單一的條帶。以已知分子質量的標準蛋白為參照,根據蛋白質的遷移率與其分子質量的對數的關系繪制出標準曲線,確定純化后酶的分子質量。

1.2.6 酶學特性的研究

采用絞股藍皂苷糖苷酶的酶活力測定方法,對酶反應的條件進行研究,確定酶反應最適溫度和最適pH,研究金屬離子對酶的影響,計算出絞股藍皂苷糖苷酶的動力學方程參數。

2 結果與討論

2.1 絞股藍皂苷糖苷粗酶的活力檢測

以20%的槐花為誘導物配制培養基裝入三角瓶中,121 ℃濕熱滅菌20 min,無菌條件下接入菌種Absidiasp.GYP4r數環,30 ℃ 下培養6～7 d,提取粗酶液備用。配制1 mg/mL 的絞股藍皂苷0.1 mL作為底物與等體積的粗酶液在40 ℃ 下反應24 h后,向反應液中加入0.2 mL的水飽和正丁醇溶液終止反應,經過短暫離心后,取上層(正丁醇層)TLC點板,并與底物作對比。由檢測的結果圖1可知,該粗酶液具有酶活力。

底,絞股藍皂苷底物;1、2,底物與粗酶液反應產物

圖1 絞股藍皂苷的酶解薄層層析圖

Fig.1 Result of enzyme reaction of gypenosidase

2.2 絞股藍皂苷酶的純化與分子質量的檢測

純化柱經過堿酸反復處理,醋酸-醋酸鈉緩沖液平衡后,向柱中加入0.8 mL 粗酶液,先用少量的醋酸-醋酸鈉緩沖液將未吸附的蛋白質洗脫下來,然后用不同濃度的KCl梯度洗脫，同時以3 min/ 管的速度收集洗脫液,并檢測OD值,得到相應的洗脫曲線如圖2所示。

圖2 絞股藍皂苷酶梯度洗脫曲線圖

取各個吸收峰的峰值管收集的洗脫液0.1 mL,與等體積的絞股藍皂苷底物在pH 5.0,40 ℃下反應24 h,然后加0.2 mL水飽和正丁醇終止反應,取正丁醇層,TLC點板結果如圖3所示,16、19管收集的酶液具有相對較強的酶活力。

底,絞股藍皂苷底物;16、19,純化后收集酶液的管號

圖3 提純后的酶薄層層析圖譜

Fig.3 The layer chromatogram of purified enzyme activity

分別取14～22號管收集的酶液0.8 mL加0.36 mL三氯乙酸,4 ℃靜置沉淀10 min,4 ℃下離心5 min,倒掉上清,用濾紙吸掉殘余的水分,向其中加入50 μL的丙酮,4 ℃下離心5 min,棄丙酮并用濾紙吸干,加50 μL醋酸-醋酸鈉緩沖液和等體積的上樣緩沖液將蛋白質溶解,煮沸3～5 min。將處理好的樣品進行凝膠電泳，檢測結果如圖4所示,16、19號的酶液得到電泳圖譜比較清晰,易于分析。

電泳條帶為單帶,說明該蛋白質是純的蛋白質。再根據蛋白質的遷移率與蛋白質分子質量的對數關系繪制出標準曲線,經計算處理得到回歸方程logY=5.0-0.91X,再將待測的蛋白質遷移率代入方程中,計算出純化后蛋白質的分子質量約為68 ku。

16、19為提純后的酶

圖4 絞股藍皂苷提純酶SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

Fig.4 Polyacrylamide gel SDS electrophoreses of purified gypenosidase

2.3 酶的最適pH 及穩定性的研究

分別配制0.02 mol/L pH為2.2、3～10的緩沖液，將絞股藍皂苷溶解作為底物,40 ℃下保持30 min,取0.1 mL的酶液與等體積的底物混合,40 ℃下反應24 h,然后加0.2 mL的水飽和正丁醇終止反應,振蕩分層后取上層作薄層層析,檢測相對酶活力,繪制pH的穩定性曲線如圖5所示。由圖5可以看出,酶反應的最適pH為5,在pH 2.2～8.0相對酶活力大于50%,此范圍即為酶的pH穩定范圍。

圖5 絞股藍皂苷糖苷酶的最適pH及穩定性曲線

2.4 酶的最適溫度及穩定性的研究

在pH 5.0的條件下,取0.1 mL絞股藍皂苷底物與等體積的酶液混合,分別在20～80 ℃下反應24 h,然后加0.2 mL的水飽和正丁醇終止反應,振蕩分層后取上層作薄層層析,檢測相對酶活力,繪制溫度穩定曲線如圖6所示。由圖6可知,在溫度為40 ℃時相對酶活力和酶活均為最高,因此確定酶反應的最適溫度為40 ℃,相對酶活力大于50%的區間為20～60 ℃,此區間即為酶的溫度穩定性區間。

圖6 絞股藍皂苷糖苷酶的最適溫度曲線

Fig.6 Optimal temperature and temperature stability of gypenosidase

2.5 金屬離子對絞股藍皂苷糖苷酶的影響

以絞股藍皂苷作為酶反應底物,向反應體系中加入不同濃度的7種金屬離子,在pH 5.0、40 ℃ 下反應24 h,薄層層析檢測,計算相對酶活力,結果如表1所示。由表1可以看出,Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+對絞股藍皂苷糖苷酶的影響不大,而Cu2+對該酶有一定的抑制作用，并且抑制作用隨著Cu2+的濃度的增大而增強,當Cu2+濃度達到200 mmol/L的時候,絞股藍皂苷糖苷酶的相對酶活力降至45.5%。

表1 金屬離子對絞股藍皂苷糖苷酶相對酶活力的影響

Tab.1 Effect of metal ions on enzyme relative activity %

2.6 絞股藍皂苷糖苷酶米氏常數的測定

將1、2、4、6、8 mg/mL不同質量濃度的底物與酶液反應,薄層層析檢測酶活力,繪制米氏常數雙倒數曲線,如圖7所示。根據圖7得到雙倒數曲線方程為1/V=30.83/S+2.17,其中Vmax=0.46 mmol/(L·h),Km=14.20 mmol/L。

圖7 絞股藍皂苷糖苷酶的Lineweaver-Burk圖

3 結 論

由Absidiasp. GYP4r菌所產的絞股藍皂苷糖苷酶，經柱純化后,SDS-PAGE檢驗得到單帶,證明其為純酶,分子質量約為68 ku。

酶的性質研究結果表明,該酶的最適pH為5.0,酶反應最適溫度為40 ℃；該酶在20～60 ℃,pH 2.2～8.0酶活力相對穩定。Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Ca2+對該酶沒有影響,Cu2+對酶活力有一定的抑制作用。該酶的米常數值為14.20 mmol/L,最大反應速率為0.46 mmol/(L·h)。

以上研究結果為今后絞股藍皂苷糖苷酶的開發利用及制備高活性低糖基絞股藍皂苷提供了參考依據。

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[3] MEGALLI S, AKTAN F, DAVIES N M, et al. Phytopreventative anti-hyperlipidemic effects of Gynostemma pentaphyllum in rats[J]. Journel of Pharmacy & Pharmaceutical Science, 2005, 8(3):507-515.

[4] 柳海,楊宇,金鳳燮,等. 絞股藍皂苷酶轉化產物的分離純化及鑒定[J]. 大連工業大學學報, 2010, 29(2):98-100.

(LIU Hai, YANG Yu, JIN Feng-xie, et al. Isolation and identification of gypenoside in gypenoside hydrolysate[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2010, 29(2):98-100.)