硫胺素調控奶牛微生物發酵適宜添加量的篩選

喻禮懷 郝志敏 付 聰 王夢芝 王洪榮

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州225009）

近年來，關于硫胺素在反芻動物方面的研究已有相關的報道。本實驗室的前期研究表明，奶牛在常規日糧(精粗比為3∶7)條件下飼喂可以不添加硫胺素。而在高精料日糧下反芻動物日糧中有必要添加硫胺素。因此有必要通過試驗來確定硫胺素的適宜添加量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鹽酸硫胺素：純度≥99%（Solarbio）。

1.2 試驗動物及底物組成

從揚州大學試驗牧場選取體重接近、身體健康及安裝永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛4頭。試驗底物及硫胺素添加量見表1，人工唾液鹽的配制見表2。

表1 底物組成與硫胺素的添加量

1.3 試驗設計及飼養管理

試驗采用單因子試驗設計，5個硫胺素水平，分別是0、60、120、180和240 mg/kg。對照組不添加鹽酸硫胺素，試驗組分別添加不同劑量的鹽酸硫胺素（純度≥99%，硫胺素的有效含量分別為0、53.5、107.0、160.5、214.0 mg/kg），每組3個重復。

表2 人工唾液鹽緩沖液組成含量（g/l）

采集瘤胃液用于體外培養，培養底物是半純合日糧，其精粗比設計為6∶4。培養時間72 h。分別在0、1、3、6、10、24、48、72 h采集培養液。試驗期間每日7:00和19:00兩次等量飼喂，自由飲水，用于采集瘤胃內容物樣品。

人工唾液鹽緩沖液在使用前1 d配制（見表2）并通入CO2待用。

1.4 體外培養步驟

早晨飼喂前采集奶牛瘤胃液，裝在自制真空負壓裝置。每頭瘺管牛采集100 ml瘤胃液，過濾后裝入保溫瓶。往保溫瓶通入CO2，并置于恒溫水浴中保溫。

培養試驗前3 h配制人工唾液鹽，即配即用。每個重復（培養瓶）添加1.2 g配制好的底物，并按上述試驗設計添加硫胺素；之后添加配制好的人工唾液鹽80 ml，再各加入采集好的并經過過濾的瘤胃液40 ml，通入CO2至飽和，置于恒溫水浴中保溫。另設只含有人工唾液鹽和瘤胃液的空白對照，培養72 h。分別在0、1、3、6、10、24、48、72 h采集培養液，每次采集15 ml，分裝在5 ml和10 ml的離心管中，測定pH值，并將樣品置于-20℃保存，測定相關指標。培養72 h后，收集培養液，分裝在10 ml離心管，-20℃保存，進行微生物分離及指標測定。

1.5 指標測定

使用pHS-3C型pH計測定pH值；使用苯酚-次氯酸鈉比色法測定氨氮濃度；微生物的分離采用Mar?tin-Orue等的方法進行測定；微生物蛋白的測定采用三氯乙酸沉淀蛋白法進行測定。

1.6 數據處理

用Excel軟件進行數據整理，用SPSS Statistics 17.0統計軟件分析數據。方差分析采用比較均值中的單因素ANOVA分析，顯著性檢驗采用LSD多重比較。數據以“平均值±標準誤”表示，標準誤用SEM表示，顯著性用P表示。

2 結果

2.1 高精料日糧條件下硫胺素對培養液pH值的影響（見表3、圖1）

表3 高精料日糧條件下不同硫胺素水平對培養液pH值的影響

圖1 高精料日糧條件下硫胺素對培養液pH值的影響

由表3可見，除24 h時間點外，各試驗組與對照組相比，培養液pH值差異不顯著（P＞0.05）。培養液中瘤胃微生物降解營養物質，生成揮發性脂肪酸，致使各組pH值隨時間呈下降趨勢，基本在72 h時降到最低點。24 h時，B試驗組與對照組相比，培養液pH值差異極顯著（P＜0.01)，B試驗組與D試驗組相比，培養液pH值差異極顯著（P＜0.01)。

2.2 高精料日糧條件下不同硫胺素水平對培養液氨氮濃度的影響（見表4、圖2）

表4 高精料日糧條件下不同硫胺素水平對培養液氨氮濃度的影響(mg/100 ml)

圖2 高精料日糧條件下硫胺素對氨氮濃度的影響

由表4可見，隨著硫胺素添加量的增加，各試驗組氨氮濃度整體上均低于對照組A組，且各個試驗組之間整體上差異均不顯著（P＞0.05），在培養1 h時，D、E試驗組極顯著低于對照組，B、C試驗組與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

從同一時間點看，相比于對照組，試驗各組培養液的氨氮濃度均呈現下降的趨勢，NH3-N濃度隨時間點的變化來看，試驗各組氨氮濃度的變化趨勢與對照組大體上都相似，隨培養液培養時間的延長呈先升高后緩慢下降然后又緩慢上升的趨勢。1 h時，對照組極顯著高于D組和E組（P＜0.01）。

2.3 高精料日糧條件下硫胺素對培養液原蟲蛋白產量的影響（見表5、圖3）

表5 高精料日糧條件下硫胺素對培養液原蟲蛋白產量的影響(mg/ml)

圖3 高精料日糧條件下硫胺素對原蟲蛋白產量的影響

由表5可見，隨著硫胺素水平增加,各組原蟲蛋白產量總體上表現為先下降后上升的趨勢,72 h時的原蟲蛋白產量最高。在48 h時,D試驗組原蟲蛋白產量極顯著低于對照組(P＜0.01)，而其它各試驗組的原蟲蛋白產量與對照組相比差異均不顯著；在72 h時，D試驗組原蟲蛋白產量和E試驗組原蟲蛋白產量極顯著低于對照組(P＜0.01)。

2.4 高精料日糧條件下硫胺素對培養液細菌蛋白產量的影響（見表6、圖4）

表6 高精料日糧條件下硫胺素對培養液細菌蛋白產量的影響(mg/ml)

圖4 高精料日糧條件下硫胺素對細菌蛋白產量的影響

由表6可見。隨著硫胺素水平增加，細菌蛋白產量呈現上升趨勢，各試驗組的細菌蛋白產量與對照組的細菌蛋白產量相比差異不顯著(P＞0.05)。各組細菌蛋白產量總體上表現為先上升后下降的趨勢，總體上看，6～10階段較高，而48～72 h階段較低。在72 h時，B試驗組細菌蛋白產量和D試驗組細菌蛋白產量極顯著高于對照組(P＜0.01)，而其它各試驗組的細菌蛋白產量與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)。

3 討論

3.1 高精料日糧條件下硫胺素對瘤胃培養液pH值的影響

在反芻動物養殖中，飼喂方法、日糧組成、瘤胃內乳酸及揮發性脂肪酸等其它有機酸產生、吸收利用等因素均會影響瘤胃液的pH值，因此，我們通常所認為衡量瘤胃發酵水平和內環境綜合指標的是瘤胃液的pH值。

本試驗中對照組和各個試驗組所記錄的所有的培養液pH值的變動范圍分別是6.00～7.30，5.98～7.32，6.03～7.34，6.03～7.35和6.01～7.32。體外發酵開始后，錐形瓶中的底物慢慢被瘤胃微生物降解生成乳酸、大量的揮發性脂肪酸以及其它一些有機酸，這些酸產生速度遠高于微生物利用速度，以致pH值下降。隨培養時間增加，瘤胃中相關微生物活動能力減弱，利用酸性物質能力降低，以致之前產生的酸性物質等其它次生代謝產物又不能及時外排，所以導致培養液pH值緩慢下降。培養結束后，與對照組相比，其它各試驗組pH值都不同程度地升高，說明高精料日糧條件下模擬體外發酵試驗中添加硫胺素有提高pH值的趨勢。

3.2 高精料日糧條件下不同硫胺素水平對瘤胃液氨氮濃度的影響

飼料中蛋白質的含量、飼料中蛋白質在瘤胃內降解的特性、能量供應以及微生物蛋白的合成情況可以由瘤胃液中氨氮水平來反映。瘤胃內氨氮是非纖維分解菌的部分氮源，更是纖維分解菌的必需氮源，因此氨氮濃度也是體現瘤胃中微生物活力的一個很重要的指標，微生物蛋白高效率的合成一定要微生物提供充足的氮源。

本試驗中瘤胃液氨氮濃度的變動范圍是17.29～37.81 mg/100 ml。體外培養72 h后，各試驗組的氨氮濃度均高于對照組。5組氨氮濃度隨培養時間的變化規律相似，培養1 h后，各試驗組瘤胃液氨氮濃度達到一個最高點，這其中主要的一個原因是瘤胃中尿素酶的活性高，這種酶能降解尿素釋放氨氮，這樣氨氮濃度就會上升；隨后濃度開始下降，這是因為瘤胃微生物開始吸收和利用氨氮；在發酵快結束的時候氨氮濃度又開始緩慢回升，這其中一個可能的原因是纖毛蟲自溶或細菌溶菌作用開始釋放氨所導致的。

3.3 高精料日糧條件下硫胺素對微生物真蛋白產量的影響

瘤胃微生物利用發酵產生的揮發性脂肪酸、糖類以及ATP等作為生長所需的能源，再利用日糧中粗飼料蛋白及精料中玉米等的蛋白通過降解而產生的各種氨基酸等作為氮的來源來合成MCP，可以給動物機體提供充足的能量。MCP的合成受碳水化合物(NFC)的種類和含量、動物飼糧中可降解蛋白、瘤胃內環境、飼糧中的蛋白水平以及能氮釋放等的影響。

本試驗中尿素為微生物發酵提供充足氮源，但微生物合成蛋白需要其它可利用能量。隨硫胺素添加，原蟲蛋白產量下降。這其中主要的原因是添加硫胺素后，瘤胃液的滲透壓發生改變，種屬原蟲的細胞壁比較薄，對滲透壓的敏感性較強而對存活率造成了一定的影響。細菌蛋白產量各個試驗組整體上均高于對照組，細菌蛋白產量有所提高，因為硫胺素是碳水化合物代謝中必不可少的一種水溶性維生素。添加硫胺素促進碳水化合物代謝，飼料能量的利用率也隨之提高，其中以180 mg/kg的添加量效果最顯著。

4 結論

①高精料日糧條件下添加硫胺素有提高瘤胃液pH值的趨勢，可以提高細菌蛋白產量，但降低了培養液的氨氮濃度。

②結合奶牛瘤胃內環境指標，本試驗推薦硫胺素最佳添加水平為180 mg/kg。

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