特種野豬ESR基因、FSHβ基因的多態性分析

何若鋼 劉 謹 劉丁健 劉桂武 張家富 李斯麗 涂興強 言 穩

（廣西大學動物科技學院，廣西南寧 530005）

特種野豬也稱為雜優野豬，它是以純種野公豬作為父本、優良瘦肉型豬或者本地豬為母本進行雜交，雜交后代再與純種野公豬進行回交，以提高特種野豬的含野血緣，這樣形成的一種野豬稱為特種野豬。特種野豬具有濃郁的野味以及較高的瘦肉率，其肉質鮮美柔嫩香醇,脂肪含量低，營養豐富全面，含有很多種氨基酸以及很多種微量礦物質元素，漸漸成為當代新型的綠色食品。目前在市場上十分暢銷，尤其是香港、廣州、北京、上海等發達都市需求量相當大，特種野豬肉50元/kg仍然供不應求。

特種野豬是優良山林野公豬與優良瘦肉型母豬進行多次雜交后，經人工多次馴化的雜優野豬，其基因穩定，不易產生變異，后代可以長期做種繁殖而基因保持穩定。由于特種野豬是野豬與家豬的雜交產物，表現出很好的雜交優勢，家豬、野豬的優點于一身,它既保持了純種野豬肉質鮮嫩、風味鮮美、瘦肉率高、抗病力強、耐粗飼能力強、對環境的適應性好的優勢，又保持了家豬生長速度快、飼料轉化率高、繁殖力強的特點，并且克服了純種野豬生長慢、體形偏小、季節性繁殖的缺點。所以養殖特種野豬已變成養殖業中的熱門話題，屬于國家科技部星火計劃推廣項目之一。從分子遺傳學角度對特種野豬的優異特性進行全面研究非常必要。本研究收集了72頭含50%野豬血緣的特種野母豬耳組織樣品，對影響繁殖性狀的主要功能基因（ESR、FSHβ）的多態性進行檢測和分析，通過分子育種的手段提高特種野豬的產仔數，提高特種野豬的繁殖性能，為特種野豬遺傳資源的保護和開發利用提供基礎資料及科學依據。

1 材料和方法

1.1 樣本采集和基因組提取

本研究共采集了72頭含50%野豬血緣的特種野母豬耳組織樣品。樣品來自上思縣毆達畜牧業有限責任公司旗下的特種野豬馴養場。耳組織樣用裝有70%乙醇的試管帶回實驗室，置于-20℃的冰箱保存備用。鹽析法提取基因組DNA。

1.2 儀器和材料

蛋白酶 K，Sigma 公司；MarkerDL2000：takara 公司;2Xtaq Master Mix：北京天根生物有限公司；Taq酶、dNTP、MgCl2，MgSO4、PCRbuffer，Promega 公司；GelRed核酸凝膠染色劑：美國Biotium公司；無水乙醇、異丙醇等常規國產試劑：成都市成龍化工廠；瓊脂糖：西班牙Biowest原裝；瓊脂糖膠回收試劑盒:北京天根生物有限公司。

1.3 引物設計

ESR和FSHβ基因的引物如表1所示。

1.4 PCR擴增

1.4.1 反應體系

反應總體積分別為 50 μl和 25 μl，包括：①ESR PCR 反應體系：2Xtaq Mastermix，25 μl；ESR 上游引物（20 μmol/l）1 μl；ESR 下游引物 (20 μmol/l)1 μl；DNA模板（20 ng/μl）1 μl；滅菌 ddH2O 22 μl。②FSHβPCR反應體系：2Xtaq Mastermix，12.5 μl；FSHβ 上游引物（20 μmol/l）0.5 μl；FSHβ 下游引物（20 μmol/l）0.5 μl；DNA 模板（20 ng/μl）0.5 μl；滅菌 ddH2O 11 μl。

表1 ESR和FSHβ基因的引物序列

1.4.2 反應程序

ESR PCR反應程序為：95℃預變性3 min；94℃變性 1 min；56℃退火 30 s，72℃延伸 30 s；返回第2步，進行35個循環；72℃再延伸5 min；4℃保溫。

FSHβ PCR反應程序為：95℃預變性3 min；94℃變性1 min；55℃退火45 s,72℃延伸45 s；返回第2步,進行35個循環；72℃再延伸5 min；4℃保溫。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳及ESR片段的膠回收

擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳（5V/CM），在微波爐加熱后加入適量的核酸染料GelRed，電泳緩沖液為1×TAE，在伯樂凝膠成像系統中成像觀察并切膠、回收特異性目的片段（ESR），回收方法按照天根生化公司的膠回收試劑盒進行。將回收片段樣品進行酶切分析。

1.6 PCR產物酶切

PCR酶切方法是首先取5 μl PCR產物到PCR管中，然后加入1.2 μl內切酶PvuⅡ，同時加入1 μl 10×buffer的內切酶PvuⅡ稀釋液，加入12.8 μl滅菌超純水，總共是20 μl體積，放在37℃水浴鍋中水浴8 h，最后于4%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 ESR、FSHβ基因型分析

ESR基因型分析：ESR基因中B等位基因一個堿基對發生點突變，導致ESR基因座位等位基因表現出差異。這種差異產生了一個限制性內切酶PvuⅡ的酶切位點，ESR基因的PCR產物經限制性內切酶PvuⅡ酶切后呈現出多態性，根據其條帶的數目和位置，確定有AA、AB、BB 3種基因型，其等位基因A的片段為121 bp，等位基因B的片段為（56+65）bp。據此，AA基因型為一條帶，為121 bp，AB基因型為三條帶，為 121、65、56 bp，BB 基因型為兩條帶，為 65 bp和56 bp。

FSHβ基因型分析：FSHβ基因中A等位基因在其第1內含子中存在1個292 bp的逆轉座子插入突變,導致A、B等位基因的長度出現差異,這造成FSHβ基因座位的等位基因差異,這種差異在電泳中產生不同圖譜，其等位基因A的擴增片段為500 bp,等位基因B的擴增片段為220 bp。據此也可將FSHβ基因座位分為AA，AB和BB 3種基因型，若擴增結果出現500 bp的單條帶則為AA型,若出現500 bp和220 bp兩條帶則為AB型,若出現220 bp一條帶則為BB型。

1.8 數據處理

分析所有基因圖譜，整理基因型數據，計算所測特種野豬群ESR基因以及FSHβ基因中不同基因型的基因型頻率、各等位基因在整個群體中出現的基因頻率，用SPSS分析各基因型產仔數的差異顯著性，數據用平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 ESR-PCR擴增以及酶切結果

2.1.1 ESR-PCR擴增結果

PCR擴增產物電泳圖譜見圖1。

2.1.2 ESR酶切結果

擴增產物經限制性內切酶Pvu Il酶切后出現多態，在圖中根據條帶的數目和位置，我們可以確定有AA、AB 兩種基因型，分別為（AA 121 bp）；AB（3條帶，65+56+121 bp）

2.2 FSHβ-PCR擴增結果

FSHβ經PCR擴增后其擴增產物于1%瓊脂糖凝膠檢測，電泳圖譜如圖4和圖5。基因只表現出AA和AB兩種基因型。其頻率分別為91.67%和8.33%，等位基因A和B的頻率分別為95.83%和4.17%，AA型以及等位基因A的頻率均超過90%，在群體中占據明顯的優勢地位。FSHβ亞基基因表現出三種基因型AA、AB和BB，其頻率分別為11.11%、55.56%以及33.33%，AB型為優勢基因型。等位基因A和B的頻率分別為38.89%和61.11%，等位基因B在群體中占據優勢。

2.3.2 ESR、FSHβ不同基因型與產仔數關系

在被檢特種野豬群體中ESR基因缺少BB型，ESR基因、FSHβ亞基基因不同基因型之間與總產仔數、產活仔數以及初生重的關系見表3。

表3 特種野豬ESR、FSHβ不同基因型與產仔數關系

2.3 統計分析結果

2.3.1 ESR、FSHβ亞基因多態在特種野豬中的分布及作用

在所檢測的72頭特種野豬中ESR和FSHβ亞基基因不同，基因型分布（頭數）、基因型頻率和基因頻率見表2。

表2 特種野豬ESR和FSHβ基因的基因型頻率及基因頻率

從表2可以看出，在所檢測的特種野豬中，ESR

由表3可知，在所檢測的特種野豬群中，ESR基因中AA和AB兩種基因型對應的豬總產仔數、產活仔數存在顯著差異(P＜0.05)，且AB＞AA基因型，AB型比AA型的豬總產仔數、產活仔數分別高1.94頭以及1.9頭。不同基因型對仔豬出生重的影響差異不顯著（P＞0.05）。FSHβ基因AA、AB和BB三種基因型對應的豬總產仔數和產活仔數均以BB型最高，顯示出BB＞AB＞AA基因型的趨勢。其中BB型對應的豬總產仔數顯著高于AA型（P＜0.05），比AA型高1.33頭，BB型產活仔數顯著高于AA型以及AB型（P＜0.05），分別高0.85頭和1.03頭。

3 討論

3.1 ESR基因多態性及其與產仔數的關聯分析

在所檢測的72頭特種野豬中，ESR基因不同基因型豬總產仔數、產活仔數均存在AB基因型＞AA基因型，且AB型豬總產仔數、產活仔數均顯著高于AA型，這表明ESR基因是控制產仔數的主基因或與產仔數主基因存在緊密連鎖，而B等位基因是增加產仔數的優勢基因。這與趙西彪等、丁家桐等研究結果一致。

李鳳娥等、Natoloczna-Kotara對不同豬品種ESR基因進行了多態性分析，統計了ESR基因B等位基因在不同品種中的頻率,結果表明：大白×梅山(0.59)、梅山豬（0.50）、中國瘦肉豬新品系 DIV2（0.68）、清平豬（0.90）、通城豬（0.67），這表明繁殖性能高的中國本地豬種含有較高優勢基因B。而在本試驗中特種野豬的ESR等位基因A的頻率為0.958 3，在群體中占絕對優勢地位，這可能是導致特種野豬產仔數偏低的主要原因。

根據試驗結論推斷，ESR為BB基因型的母豬產仔數應最多，但在本試驗所檢測的特種野豬群中ESR基因缺少BB基因型，這可能是因為等位基因B在群體中所占的基因頻率太低，不容易被檢測到所致。另外，樣本量偏小可能也是導致沒有檢測到ESR基因BB基因型的一個因素。統計結果發現仔豬初生重在不同基因型之間沒有顯著影響，這和國內外的多數報道一致，這說明ESR對仔豬初生重不產生顯著影響，只能提高母豬的產仔數。

3.2 FSHβ基因多態性及其與產仔數的關聯分析

本次在特種野豬群體中對FSHβ基因多態性的檢測共檢測到AA、AB、BB三種基因型，雖然AB基因型總產仔數與AA、BB基因型差異未達到顯著水平，AB基因型產活仔數與AA基因型差異也未達顯著水平，但三種基因型總產仔數和產活仔數呈現BB＞AB＞AA的趨勢，這表明對于FSHβ基因而言，等位基因B是影響產仔數的優勢基因，魯紹雄等在撤壩豬ESR和FSHβ基因多態性及其與產仔數的關聯分析中得到FSHβ基因對撒壩豬產仔數的影響是FSHβ亞基基因BB型為豬產仔數增效基因型，等位基因B為產仔數增效基因；周勝花等在ESR和FSHβ基因與晉陽白豬繁殖性狀關系研究中得到FSHβ基因為BB基因型的母豬產仔數最多，FSHβ基因的有利基因B頻率較高，晉陽白豬高繁殖性能可能與有利基因B的頻率較高有關。本研究與以上研究結果一致。

FSHβ亞基基因的多態性分析中發現國內地方豬種如萊蕪黑豬、香豬、二花臉豬、民豬、撒壩豬等群體中A等位基因占優勢，而在國外著名豬種中如約克夏、長白等群體中等位基因B占優勢。本研究中特種野豬FSHβ亞基B基因頻率占優勢，為0.611 1，這與報道過的其它中國地方豬種的分布頻率有很大的偏差，這可能與特種野豬在培育的過程中引入外血有關。

4 結論

在所檢測的特種野豬群中，ESR基因，AB型比AA型的豬總產仔數、產活仔數分別高1.94頭以及1.9頭。FSHβ基因BB基因型的豬總產仔數和產活仔數最高，顯示出BB＞AB＞AA基因型的趨勢，其中BB型比AA型高1.33頭，BB型產活仔數分別比AA、AB高0.85頭和1.03頭。ESR、FSHβ不同基因型對仔豬初生重的影響差異不顯著。

從本次檢測結果來看，被檢測的特種野豬ESR基因和FSHβ基因不同基因型能對產仔數產生顯著影響，因此FSHβ基因和ESR基因可以作為控制豬高繁殖率的候選基因。ESR基因能增加產仔數的優勢基因B頻率相當低，為0.041 7；而FSHβ基因中能增加產仔數的優勢基因B的頻率較高，為0.611 1。因此，對該群體來說，注意提高ESR基因中等位基因B的頻率，將能顯著提高豬群的繁殖性能。在以后的育種工作中，可以把具有ESR基因的B等位基因的個體予以保留，通過標記輔助選擇(MAS)來改良豬產仔數性狀，從而帶來巨大的潛在經濟效益。

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