不同碳氮源對地衣芽孢桿菌S6降解羽毛蛋白的影響研究

郭 剛楚 杰王君高劉可春

(1.山東輕工業學院食品與生物工程學院，山東濟南 250353；2.山東省科學院生物研究所，山東濟南 250014)

在羽毛中，粗蛋白含量高達80%以上，其中主要為角蛋白，角蛋白中除賴氨酸、蛋氨酸的含量較低外，其它動物必需氨基酸均略高于魚粉（劉雪蘭等，1999）。近年來，國內禽畜行業快速發展，動物飼料蛋白源不足的問題越來越嚴重；我國是羽毛產量大國，年產羽毛在70萬噸以上，由于羽毛很難降解，對于環境造成很大壓力；所以，充分地利用羽毛，不僅可以一定程度緩解我國動物飼料蛋白源不足的問題，還可以減輕甚至消除大量羽毛不能降解而對環境造成的壓力。

羽毛的難降解主要是因為在角蛋白的分子鏈內和分子鏈之間廣泛存在著二硫鍵、氫鍵、鹽鍵及其他的交聯作用，這些交聯作用，具有很強的抗降解能力。現在降解羽毛的方法主要有三類：高溫高壓蒸煮、化學法（酸水解和堿水解）、酶法。高溫高壓蒸煮法不但會破壞掉熱敏性的動物必需的氨基酸，生成一些無營養價值的氨基酸，而且比較耗能，影響到羽毛作為動物飼料的經濟效益，而化學法同樣存在著會破壞掉一些營養氨基酸的問題，并且化學法的后續處理會生成大量的鹽類,影響飼料的口感，使動物少進食,甚至不進食,與前兩類方法相比,酶法處理條件溫和,不會破壞掉營養氨基酸，并且不會影響口感,所以,酶法降解羽毛成為了一種很有前景的方法,但是由于角蛋白分子內與分子間交聯作用的廣泛存在,常見的蛋白酶,如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶都很難降解角蛋白。

目前，已經分離篩選出30多株降解角蛋白的菌株（Onifade A A 等，1998），主要為細菌、放線菌和真菌，它們通過分泌一種誘導酶——角蛋白酶來對角蛋白進行降解。雖然菌體本身對角蛋白酶的產生起著決定作用,但是與培養基組分和培養條件也有很大關系,如溫度、pH值、碳氮源等。雖然有報道（Manczinger L等，2003）發現，降解角蛋白的一些菌體能自身合成微量的合成型角蛋白酶，但是，底物誘導還是調節角蛋白酶合成的主要機制。Santos RMDB等（1996）發現，葡萄糖能抑制角蛋白酶的產生，進而影響角蛋白的降解，而Anbu P等（2008）的發現卻與此相反，此外，El-Naghy MA等（2008）發現，氮源能夠部分甚至完全抑制角蛋白酶的產生。

近年來，國內為了提高對羽毛的利用率，對角蛋白酶進行了大量研究，然而，酶活力低一直是提高羽毛利用率的瓶頸。地衣芽孢桿菌S6是本實驗室篩選到的降解羽毛能力很強的菌株，本實驗通過選擇9種碳源（葡萄糖、葡萄糖酸鈉、甘露糖、甘露醇、木糖、蔗糖、乳糖、異戊醇）與8種氮源（碳酸銨、氯化銨、硝酸鈉、半胱氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、尿素、肌酸），對羽毛蛋白的降解特性進行較系統的研究，不僅為提高角蛋白酶活力奠定一定的理論基礎，而且對于工業上提高羽毛蛋白的利用率具有重要意義。

1 材料方法

1.1 菌種

本實驗室保藏。

1.2 培養基

種子培養基(g/l)：酵母膏 5、蛋白胨10、氯化鈉10、瓊脂 20，pH 值 7.0。

發酵培養基(g/l):羽毛10、磷酸二氫鉀0.5、磷酸氫二鉀 1.2、氯化鈉 0.5、硫酸鎂 0.1、氯化鈣 0.2，pH 值7.0，在此基礎上分別添加碳源與氮源，其中碳源添加量為0.05 mol/l，氮源添加量為0.01 mol/l，121℃條件下，滅菌20 min。

1.3 羽毛采集

新鮮羽毛取自市場肉雞宰殺點。

1.4 羽毛處理

自來水洗凈羽毛，70℃烘干，培養基用羽毛為完整羽毛，測酶活用羽毛為挑選出的絨毛，剪碎。

1.5 主要儀器

超凈臺、培養箱、分光光度計、搖床、水浴搖床、離心機。

1.6 搖瓶發酵

取培養14 h的種子液1 ml，接種于裝有30 ml發酵培養基的250 ml三角瓶中，37℃、100 r/min，培養72 h。

1.7 酶活測定

參照蔡成崗等(2009)測定角蛋白酶酶活的方法，略有改動：取5 ml發酵液，5 000 r/min，離心10 min，取1 ml上清液加入盛有10 mg羽毛與2 ml pH值8.0的0.05 mol/l Tris-HCl離心管中,其余上清液以備測定可溶性蛋白，50℃、100 r/min條件下反應1 h后，加入2 ml 10%TCA 終止反應，5 000 r/min，離心 10 min，用pH值8.0的0.05 mol/l Tris-HCl把上清液稀釋2倍，然后在280 nm處測定吸光度，空白組同試驗組，在加上清液前加入2 ml 10%TCA。酶活單位定義為試驗組對空白組每增加0.01吸光度所需要的酶量。

1.8 可溶性蛋白測定

可溶性蛋白的測定參照陳鈞輝等（2003）的方法。

1.9 pH測定

pH測定采用pH計測定方法。

1.10 數據處理

每個測定量3個重復，取值均為其均值，數據處理通過Excel 2007和SPSS 17.0軟件完成。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對地衣芽孢桿菌S6降解羽毛蛋白的影響

在微生物細胞中，碳源不僅是微生物生長重要的結構物質，還是微生物生長代謝重要的能源承擔者，此外，碳源還是一些大分子合成所必須的中間體，并且在微生物細胞內的信息傳遞中起著重要的作用。角蛋白酶是種誘導酶，具有底物直接誘導及對誘導物特異性要求較低的特點(李江等，2006)，碳源作為微生物生長代謝的重要營養物質，是影響角蛋白酶產生的重要因素，對地衣芽孢桿菌S6降解羽毛蛋白的能力影響很大。

在本試驗開始之前，首先對滅菌后的發酵液pH值進行測定(結果未列出)，發現外加碳源處理對溶液改變較少，所以在后續的發酵中未作調節。基于以前的研究，地衣芽孢桿菌S6在以羽毛為唯一碳氮源發酵，72 h后，可溶性蛋白量和酶活力達到最高。外加不同碳源處理的發酵液（碳源濃度均為0.05 ml/l）中，地衣芽孢桿菌S6降解羽毛72 h的酶活力，可溶性蛋白量如圖1、表1。

表1 不同碳源處理發酵液可溶性蛋白量比較

從圖1可以看出，除外加異戊醇的發酵上清液角蛋白酶活力低于沒有外加碳源發酵上清液角蛋白酶活力外，其它外加碳源的發酵上清液角蛋白酶活力均明顯高于沒有外加碳源發酵上清液角蛋白酶活力，其中以麥芽糖為最顯著，與沒有外加碳源發酵上清液角蛋白酶的活力相比，提高近3倍。

利用SPSS17.0選用P＜0.05時，對獲得試驗數據單因素方差分析，表明不同的外加碳源發酵液酶活力之間差異具有顯著性，在此基礎上進行多重比較表明，外加碳源的處理組和沒有添加碳源發酵液角蛋白酶活力之間的差異均具有顯著性，其中，異戊醇抑制了發酵液中角蛋白酶的活力，其它的都對發酵中角蛋白酶活力起到促進作用，其中，尤以添加麥芽糖的發酵液酶活力提高最多。

從表1可以看出，沒有外加碳源的發酵液可溶性蛋白只有226.05 μg/ml，而外加麥芽糖的發酵液可溶性蛋白量最高,達到30 672.07 μg/ml,提高了近135倍,除異戊醇、葡萄糖酸鈉外，其它碳源對發酵液可溶性蛋白量的影響也很顯著。

從圖1、表1中可以發現，雖然在發酵液體系中，可溶性蛋白的產生是由于角蛋白酶降解羽毛蛋白產生的，但可溶性蛋白量和酶活力之間在數值并沒有顯著的相關性，這主要是因為在羽毛蛋白的降解過程中，可溶性蛋白的量是動態變化的，它不斷的產生，同時，也會被地衣芽孢桿菌S6不斷的利用，以維持其正常的生理代謝。

2.2 不同氮源對地衣芽孢桿菌S6降解羽毛蛋白的影響

氮源是微生物生長所需要的重要營養物質，氮在微生物細胞的干重中占到12%～15%，是構成蛋白質、核酸的重要元素。氮源作為微生物生長的重要營養物質，同樣是影響角蛋白酶產生的重要因素，對地衣芽孢桿菌S6降解羽毛蛋白也有很大影響。

通過對滅菌后外加氮源的發酵液初始pH值測定發現，外加碳酸銨、尿素的發酵液初始pH值變化較大，對它們分別調節之后，進行后續的發酵試驗。

發酵72 h后，外加不同氮源發酵液（氮源濃度均為0.01 ml/l）的酶活力，可溶性蛋白量如圖2、表2。

表2 不同氮源處理發酵液可溶性蛋白量比較

從圖2可以看出，與能提高角蛋白酶產量的碳源相比，氮源對產生角蛋白酶的影響相對較弱，在外加氮源的處理中，半胱氨酸對角蛋白酶活力的影響最大，然而，與外加碳源相比，除外添加異戊醇的處理抑制了角蛋白酶的產生外，其它外添加碳源的影響均大于外添加半胱氨酸的影響，其中，外添加麥芽糖的發酵上清液的酶活力是外添加半胱氨酸的發酵上清液酶活力的兩倍多。在外加氮源的處理中，除半胱氨酸和甘氨酸外，其余外加氮源的發酵液角蛋白酶活力均比沒有外加氮源的發酵液角蛋白酶活力低。

使用SPSS17.0對獲得酶活力數據處理，當P＜0.05，單因素方差處理的結果表明各處理間差異顯著，在此基礎上進行多重分析，外加碳酸銨、氯化銨、尿素、半胱氨酸的發酵液酶活力均與沒有添加氮源的發酵液酶活力之間差異具有顯著性，其中，尿素、碳酸銨、氯化銨抑制了發酵液的酶活力，而半胱氨酸提高了發酵液的角蛋白酶活力。

從表2可以看出,各氮源處理組可溶性蛋白量之間的差異要比各碳源處理組之間可溶性蛋白量之間的差異小的多,并且,各氮源對可溶性蛋白量的影響也較小,最高的為外加甘氨酸的發酵液,為582.46 μg/ml。

從圖2、表2可以發現，與碳源類似，外加氮源的發酵液中可溶性蛋白量和酶活力之間在數值并沒有顯著的相關性，這也主要是因為可溶性蛋白量是動態變化的。

3 討論與結語

碳氮源是微生物生長必須的兩類最重要的營養物質，角蛋白酶是種誘導酶，具有底物直接誘導和對誘導源要求較低的特點，本試驗通過外加不同的碳氮源對地衣芽孢桿菌S6降解羽毛蛋白的影響進行研究發現，總體而言，碳源對地衣芽孢桿菌S6降解羽毛蛋白的影響要比氮源大的多，這從發酵液的酶活力和可溶性蛋白量可以看出，外加碳源組發酵液角蛋白酶活力最高達到224.5 U/ml，可溶性蛋白最高達到30 672.07 μg/ml，而外加氮源組發酵液角蛋白酶活力最高為101.55 U/ml,可溶性蛋白最高只為582.46 μg/ml。

Santos RMDB等發現，一些糖類能抑制角蛋白酶的產生，進而影響角蛋白的降解，但在本試驗中，大部分碳源不僅沒有抑制角蛋白酶的活力，反而極大提高了角蛋白酶的活力，很大程度上促進了羽毛蛋白的降解，本試驗外加氮源對地衣芽孢桿菌S6降解羽毛的影響與El-Naghy M A等的報道不同，一些氮源不但沒有抑制角蛋白酶活力，反而一定程度上提高了角蛋白酶的活力，如甘氨酸、半胱氨酸，促進了羽毛蛋白的降解。這可能與碳氮源的加入量有很大關系，微量的碳氮源可能對芽孢的萌發及角蛋白酶的產生有激活作用，只有當碳氮源的添加量在合適的水平，才能夠促進羽毛蛋白的降解。過多或過少對其可能都產生反作用，其作用機理還需進一步探討。目前羽毛利用率得不到提高，很大程度是因為角蛋白酶的活力太低，本研究的結果對于提高羽毛的利用率有重要的現實意義，同時對于環境保護也有一定的意義。

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