蒲公英內生真菌PG2分子鑒定及抑菌物質的研究

張慧茹 伊艷杰 趙紅月 袁 元 李偉南

(河南工業大學生物工程學院，河南鄭州 450001)

天然產品是從微生物、植物或動物自然衍生出的代謝物和/或副產物，這些產品已為人類使用數千年，而植物化合物上百年來一直是醫藥的主要來源。隨著植物資源的利用和開發，大量珍稀植物遭到嚴重的破壞，而其產生的藥物來源也受到影響。美國蒙大拿州立大學Strobel小組于1993年在Science上發表文章：從短葉紅豆杉中分離得到一株能合成抗癌藥物紫杉醇的內生真菌，證明內生真菌具有合成與宿主植物相同或相似生物活性物質的功能[1]。這一發現推動從藥用植物中分離內生菌，利用植物內生菌發酵產物生產重要的天然藥物的熱潮，因此，利用藥用植物內生菌產生新型抗性藥物，為藥用植物生長緩慢、資源緊缺而又超量耗費所引起的藥源植物匱乏和生態環境破壞的問題提供了解決新思路，也為我們利用中草藥內生菌替代中草藥作為抗病營養性飼料添加劑提供了科學的依據。

蒲公英為菊科一年生草本植物。味苦、甘，性寒，具清熱解毒、消腫散結、利尿通淋等多種功效。其主要化學成分包括綠原酸、黃酮類、萜類、植物甾醇類等，其中綠原酸為蒲公英的主要抗菌物質[2]。鮮有應用內生菌代謝產物作為治療畜禽疫病的藥物研究的報道。前期研究發現蒲公英內生真菌PG2具有抗禽類病原菌的特性[3]，本研究在前期研究的基礎上，擬采用分子生物學方法對蒲公英內生真菌PG2進行種屬地位的鑒定，并對其產生的抗菌活性物質進行初步研究，為擴寬藥物植物內生菌的應用范圍，研究蒲公英內生真菌的抗菌機理，開發新型高效的抗禽類疾病的新藥奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株

蒲公英內生真菌PG2：河南工業大學生物工程學院動物生理實驗室分離，4℃，PDA固體培養基斜面保存。

指示菌：本試驗采用禽類常見致病菌為指示菌，共用5株菌。雞大腸桿菌（Escherichia coli.）：本實驗室分離、鑒定并保藏；其余4株致病菌均購買于中國獸醫藥品監察所，雞大腸桿菌（Escherichia coli.,O78），菌株編號：CVCC1490；雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum），菌株編號：CVCC533；雞多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)，菌株編號：CVCC474；雞金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus),菌株編號:CVCC2241。

1.2 主要培養基

內生真菌采用PDA固體培養基培養；致病性指示菌采用營養瓊脂培養；內生真菌發酵采用馬鈴薯浸汁添加5%的蒲公英浸汁的液體培養基，參考戴傳超[4]的方法制作蒲公英浸汁。

1.3 PCR引物

真菌rDNA ITS序列通用引物ITS4、ITS5。由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 試驗方法

1.4.1 PG2的分子鑒定

形態學鑒定：見李偉南等前期報道[3]。分子生物學鑒定：采用改進的SDS-CTAB法[5]提取內生真菌基因組DNA并作為模板，利用ITS通用引物擴增內生真菌PG2的基因組DNA，PCR反應體系為：10×Buffer 2.5 μl，2.5 mmol/l dNTP 2 μl，引物 ITS4、ITS5(5 mmol/l)各1 μl,Taq 酶(5 U/μl)0.2 μl,模板 2 μl(40 ng),加 ddH2O補足至 25 μl。擴增條件為：95 ℃、5 min，94 ℃、30 s，55 ℃、1 min，72 ℃、1 min，35 個循環，72 ℃、10 min，然后4℃保溫。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段并切膠回收，純化目的片段。目的片段與pMD-18T克隆載體連接轉化到基因工程菌JM109中，藍白斑篩選陽性轉化子，篩選的陽性轉化子送大連寶生物工程公司測序。利用BLAST軟件對PG2的ITS序列與GenBank已登錄的相似序列進行比對,采用Clustalx1.83軟件進行序列分析并構建系統發育樹，以確定其種屬地位。

1.4.2 PG2的抑菌活性

將蒲公英內生真菌接種于含5%（V/V）蒲公英浸汁(濃度0.1 g/ml)的馬鈴薯浸汁液體培養基中[3]，28℃、160 r/min培養7 d，制備發酵液。取發酵上清液，以獸藥監察所購買的4種禽類強致病菌為指示菌，采用打孔法進行抑菌試驗，每孔加入約15 μl上清液，以硫酸鏈霉素為陽性對照。試驗重復3次，抑菌直徑結果取平均值。

1.4.3 抑菌活性物質的類別鑒定

利用各類有效活性成分的顏色反應，對發酵液中的抑菌活性物質的成分初步鑒定。利用碘與生物堿反應生成無定形紅棕色沉淀以檢驗生物堿的存在；以黃酮類化合物與三氯化鋁發生顯色反應來檢識黃酮類物質的存在；通過糖類的斐林試劑法來進行糖類物質的檢識；以氨基酸的雙縮脲反應進行蛋白質、氨基酸類、肽類物質的檢識；以酸類物質的顏色反應（溴酚藍遇酸呈黃色）進行檢識；以酚類與三氯化鐵呈紫色判斷酚類物質的存在。

1.4.4 抑菌活性物質的熱穩定性

將發酵液置于 25、60、80、90、121 ℃ 5 個不同溫度下處理30 min，以本實驗室分離的雞大腸桿菌為指示菌，采用平板打孔法測抑菌圈直徑，以室溫25℃為對照。試驗重復3次，結果取平均值。

1.4.5 活性物質的極性分析

采用極性由小到大的3種試劑：石油醚、正丁醇、乙酸乙酯，對發酵液進行連續萃取，每種萃取液萃取3次，分別收集各萃取相、萃余相，采用旋轉蒸發儀40℃減壓濃縮除去萃取有機溶劑，以大腸桿菌（O78）為指示菌進行抑菌試驗判斷活性物質的極性大小，同時對3種溶劑的抑菌性進行檢驗作為對照。試驗重復3次，結果取平均值。

1.4.6 活性物質的初步分離

以300～400目的硅膠裝柱(30 mm×500 mm),取PG2發酵液有效成分所在萃取溶劑,40℃減壓濃縮,取50 ml濃縮液上樣。以環己烷：正丁醇為9：1，8：2，7：3，6： 4，5： 5，4： 6，3： 7，2： 8，1： 9 的溶液為洗脫劑,每次加入50 ml洗脫液，調整流速為3～4 ml/min，按每瓶10 ml進行收集，以雞大腸桿菌（O78）為指示菌，通過抑菌試驗檢測洗脫液中活性物質的抑菌效果。

1.4.7 有效活性物質的紅外光譜（IR）結構分析

采用溴化鉀片壓片法，將分離得到的抑菌活性物質洗脫液，滴一滴放在拋光鹽片上，將另一拋光鹽片覆蓋，輕輕壓緊并輕微轉動，形成無氣泡的液膜，進行紅外光譜結構分析。

2 結果與分析

2.1 內生真菌的分子生物學鑒定

利用真菌通用引物ITS4、ITS5擴增菌株PG2的ITS-5.8 S rDNA片段。目的片段測序結果表明：該目的片段的基因大小為560 bp，將所得序列提交Gen－Bank，獲得登錄號：HQ232415。

使用BLAST程序對所得序列在Genebank中進行同源性比較。綜合同源性比對結果，從GenBank中選擇基因序列同源性在99%的真菌序列片段。應用Clustalx1.83軟件進行比較后構建系統發育樹，如圖1所示。由圖1可以看出，PG2與半知菌門、叢梗孢科、尾孢霉屬在同一分支上，因此將PG2確定為半知菌門、叢梗孢科、尾孢霉屬（Cercospora sp.）。

2.2 PG2的抑菌活性

以中國獸醫藥品監察所購買的4種禽類強致病性致病菌為指示菌，用PG2發酵上清液做抑菌試驗，PG2的抑菌活性見圖2。

PG2發酵液對4種禽類高致病菌均具有高的抑菌活性。其中，對沙門氏菌和巴氏桿菌的抑菌效果高于鏈霉素陽性對照，證實PG2為廣譜、高效抑菌的內生真菌。

2.3 抑菌活性物質的類別鑒定

利用各種有效活性物質的顏色反應，對PG2發酵液中抑菌成分可能的化學物質類別進行初步鑒定。經化學成分鑒定，生物堿、黃酮類、蛋白質、有機酸類、酚類等均為陰性，糖類反應為陽性。

2.4 PG2抑菌活性物質的熱穩定性

對PG2發酵液采取不同溫度處理30 min后,以本實驗室分離的大腸桿菌為指示菌,其抑菌活性見圖3。

從圖3可以看出，隨著溫度的升高，抑菌效果略有下降。因此可以證實，PG2發酵液中的抑菌物質具有熱穩定性。

2.5 抑菌活性物質極性的分析

對PG2發酵液采用極性逐級增強的溶劑連續萃取，以大腸桿菌（O78）為指示菌，對各萃取相和萃余相進行抑菌試驗，以示蹤活性物質的分布（見表1）。

由以上結果分析可見，PG2發酵液對雞大腸桿菌(O78)具有較強的抑菌活性,抑菌圈直徑為18.5 mm。隨著發酵液的連續萃取,活性物質不斷被富集、抑菌性能不斷增強,在各級萃取液中抑菌圈直徑均強于原液。活性物質主要分布在正丁醇的萃取相和乙酸乙酯的萃取相,以正丁醇萃取相的抑菌性最強,達到了25.3 mm，強于發酵液1.37倍。3種萃取溶劑無抑菌性。

2.6 抑菌活性物質的初步分離和結構測定

對具有高抑菌活性的正丁醇萃取相進行濃縮、上樣、洗脫。經抑菌示蹤試驗發現，PG2正丁醇萃取相的環己烷：正丁醇(V/V)=9：1的洗脫液具有強的抑菌活性,命名為SP1。對SP1進行紅外光譜結構分析發現：SP1在 3 415.9、2 931.8、2 875.8、2 829.5、1 624.0、1 490.9、1 271.0、1 064.7、1 002.9、975.9 等處出現波峰(見圖 4)。初步分析SP1含有多糖羰基、羥基等官能團。

表1 PG2發酵液連續萃取后活性物質的分布

3 討論

目前，國內對于藥用植物內生菌的研究正在逐步增加，研究的方法和思路也在不斷改進，但限于藥用植物內生菌是一類新發現的微生物資源，對其分類方法的研究相對來說還是比較薄弱，大多數采用形態學與分子學鑒定相結合的方法，但當形態學分類和分子生物學分類存在差異時，還需要采用更多的微生物學分類方法才能準確確定其分類地位。

蒲公英是一類常用的清熱解毒類中藥，廣泛地用于人類及動物疾病的治療。鑒于蒲公英的藥用范圍非常廣泛，人們希望得到蒲公英更多的藥用活性成分，以提高治療效果。齊仁立等[6]、李喜鳳等[7]優化蒲公英有效活性物質的提取工藝，獲得較好的抗病特性；牛瑞萍[8]用黑曲霉、米根霉和枯草芽抱桿菌等微生物對蒲公英粗提物進行發酵，以提高發酵液中抗菌物質綠原酸的產量。李偉南等[3]首次分離蒲公英內生真菌的方法，獲得了高抑菌活性物質，其抗菌能力強于植物提取液，對多種致病菌均具有抵抗能力，具有廣譜抗菌性，而且對某些致病菌（沙門氏菌和巴氏桿菌）的抑菌效果強于抗生素（鏈霉素）。內生菌作為新型抗生素來源的微生物，其產生抗菌活性物質的能力還可以通過優化發酵條件和基因工程改造的方式進行人為調控，從而縮短生產抗生素的時間、提高抗菌特性，因而，從植物內生菌中生產抗生素的研究大有希望。植物內生真菌長期生活在宿主體內，其生理代謝活動與宿主體內環境密切相關[9]，一旦離開宿主植物，植物內生真菌的一些特征可能也會隨之退化、消失。在本研究中，隨著體外培養代數和發酵次數的增加，也出現菌株抗菌特性退化的問題，抑菌效果略有減弱，而新分離的內生菌株抑菌效果往往高于傳代、長期保藏過的菌株。因此，本試驗中，在培養液中加入少量的蒲公英浸提液以模擬體內環境增加抑菌效果，試驗結果證明該方法對于保持菌株的天然特性具有重要的作用。

內生真菌產生的抗菌活性物質是多種多樣、豐富多彩的[10]，這些抗菌物質的種類和作用可能不同于植物提取液，推測各種抗菌物質之間也可能存在多種相互作用、共同發揮抗菌效果。本試驗就發現在乙酸乙酯和正丁醇萃取液中均具有抗菌活性物質，甚至比正丁醇極性還大的萃余相中還有抑菌性，說明PG2發酵液能產生多種抑菌物質，本文僅對PG2正丁醇萃取相部分洗脫中高抑菌成分SP1進行結構分析，而PG2所產生的其他抑菌物質的確切結構及其抗菌特性，還需要進一步深入的研究和探索。

[1]Sticrle A,Strobel G,Sticrle D.Taxol and taxanc production by Taxomyces and reanae,an endophytic fungus of Pacific yew[J].Science,1993,260(5105):214-216.

[2]黃昌杰,林曉丹,李娟,等.蒲公英化學成分研究進展[J].中國現代中藥,2006,8(5):32-35.

[3]李偉南,張慧茹.3株蒲公英內生真菌的分離鑒定及抗禽類致病菌活性的初步研究[J].安徽農業科學,2008,36(22):9540-9542.

[4]戴傳超,余伯陽,徐曾萊,等.環境因子對烏桕內生真菌生長及脂肪酸的影響[J].應用生態學報,2003,14(9):1526-1528.

[5]黃紹輝,方炎明.改進的SDS-CTAB法提取瀕危植物連香樹總DNA[J].武漢植物學研究,2007,25(1):98-101.

[6]齊仁立,張慧茹,崔斕斕,等.蒲公英抑菌成分提取工藝的優化[J].安徽農業科學,2007,35(17):5038-5039.

[7]李喜鳳,郝哲,邱天寶,等.蒲公英中有機酸類成分的提取工藝研究[J].中成藥,2011,33(2):262-265.

[8]牛瑞萍.蒲公英發酵微生物的篩選及其對肉雞免疫指標和生長影響的研究[D].北京:中國農業科學院,2009.

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[10]Yu Hongsheng,Zhang Lei,Li Lin,et al.Recent developments and future prospects of antimicrobial metabolites produced by endophytes[J].Microbiological Research,2010,165:437-449.