降鈣素基因相關肽在大鼠切牙和牙周組織中的表達

張 靜，呂琳琳，孫 靜，陳家芳，李 紓，2

(山東濟南250012:1.山東大學口腔醫學院;2.山東大學口腔醫學重點實驗室)

降鈣素基因相關肽(CGRP)是一種具有強大擴張血管作用的生物活性多肽［1］，廣泛分布于周圍、中樞神經系統和心血管系統。近年來研究顯示:CGRP在口腔組織中的分布具有不可忽視的意義，其在正常牙髓中的陽性表達，提示這類神經肽具有神經遞質和放大刺激傳入信號的作用，從而導致疼痛和過敏癥狀［2］，同時CGRP還可調節牙髓中的血管生成以修復牙髓組織。此外，CGRP在口腔種植和正畸治療的牙槽骨愈合過程中也扮演著重要角色，并且受到了越來越多的關注。但是關于CGRP作為一種神經性因子在牙齒硬組織發育過程中的作用研究和報道較少。本研究通過觀察CGRP在大鼠切牙成釉細胞、成牙本質細胞和牙周膜細胞中的組織學定位和表達，為進一步研究CGRP在牙齒硬組織發育調控過程中的意義提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

6周齡雄性Wistar大鼠(山東大學動物中心提供);CGRP一抗(abcam，美國);山羊超敏二步法免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、胰蛋白消化液(北京中杉金橋生物技術有限公司);LEICA RM2135切片機(德國);OLYMPUS BX71顯微鏡和照相系統(日本)。

1.2 取材和標本處理

取6周齡雄性 Wistar大鼠，水合氯醛注射［0.4 mL/100 g(體質量)］麻醉后用40 g/L多聚甲醛心臟內灌注處死并內固定，取雙側下頜骨置40 g/L的多聚甲醛中再固定12 h，流水沖洗1 h后置100 g/L的EDTA液中脫鈣60 d，經針刺無阻力后終止脫鈣。取含切牙的組織塊，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，頰舌向連續切片(片厚5 μm)，展片后用多聚賴氨酸預處理的載玻片撈片，烤片3 h后置4℃冰箱內保存備用。

1.3 HE 染色觀察

選取上述切片脫蠟至水，蘇木素染色10 min，流水沖洗5 min，40 g/L鹽酸乙醇分色1 s，流水返藍10 min，伊紅染色3 min，流水沖洗至背景干凈，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并進行圖像采集。

1.4 免疫組織化學染色觀察

利用HE染色確定組織結構后，選取相鄰的切片參照山羊超敏二步法免疫組化檢測試劑盒說明進行CGRP的免疫組織化學染色。切片脫蠟至水，0.1 mol/L PBS沖洗3 min×3次;30 mL/L過氧化氫室溫孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗3 min×3次;滴加抗原復合消化液，37℃孵育20 min，PBS沖洗3 min×3次;滴加 CGRP一抗(1∶00)稀釋液，4℃過夜，復溫 5 min，PBS沖洗3 min×3次;滴加聚合物輔助劑，室溫孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次;滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min，PBS沖洗3 min×3次;滴加DAB顯色液，顯色后立即用雙蒸水沖洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片(陰性對照以PBS代替一抗重復以上步驟)。顯微鏡下觀察、照相，并按以下采集標準進行結果分析:①細胞質內無淡黃色和棕黃色顆粒，蘇木素復染后細胞核呈藍色，細胞質空白者界定為CGRP陰性表達;②細胞質內有淡黃色顆?；蛘哧栃灾怀^10%，界定為弱陽性表達;③細胞質內有棕黃色顆?；蛘哧栃灾冀M織的60%以上則界定為強陽性表達。

2 結果

2.1 組織學觀察

成釉細胞排列呈柵欄狀，細胞核極性倒置，處于分泌期。成牙本質細胞位于牙本質內側，牙周膜細胞位于成釉細胞外側，沿纖維方向規則排列，細胞呈長梭形(圖1)。

2.2 免疫組織化學染色結果

CGRP在牙周膜細胞中呈陽性表達，在胞漿中有淡黃色顆粒(圖2);在分泌期成釉細胞和成牙本質細胞中呈強陽性表達，胞漿中有棕黃色顆粒。(圖2～3)周圍牙槽骨的骨細胞中呈陰性表達;PBS陰性對照組中牙周膜細胞、成釉細胞和成牙本質細胞均呈陰性，胞漿透明，胞核藍染(圖4)。

圖1 大鼠切牙組織學觀察

圖2 成釉細胞和牙周膜細胞CGRP免疫組織化學染色

3 討論

CGRP是Rasenfeld等［3］首次利用基因重組技術合成的一種具有生物活性的神經肽，并且在隨后的研究中發現廣泛分布于周圍神經和中樞神經以及一些非神經系統組織中。CGRP由37個氨基酸組成，相對分子質量為3800 D，與腎上腺素、淀粉樣多肽同為降鈣素基因相關肽超家族的一員。CGRP受體分為CGRP 1和CGRP 2兩類，主要通過G－蛋白偶聯受體來實現生物多樣性并調節功能［4］。CGRP主要源于感覺神經纖維，由脊髓后根神經節神經元細胞產生，通過軸漿運輸到神經末梢并儲存在胞漿中。

研究發現:CGRP在口腔組織中的分布也較為廣泛，在牙髓、牙周膜和牙槽骨中的成纖維細胞、血管周圍均有陽性分布，并且能夠調節牙周組織和牙髓的血流量。近年的研究顯示:CGRP在骨生長活躍部位的分布明顯多于其他部位［5］，并且能抑制破骨細胞的活性而抑制骨吸收;也可誘導破骨細胞的增殖而促進骨改建［6］。

在牙齒發育過程中，釉質上皮細胞作為一個屏障過濾器能選擇性的為釉質的形成提供鈣運輸［7］。Gill等研究發現:CGRP能明顯增強豚鼠心房鈣內向電流并提高心肌細胞中胞內鈣［8］。Jacobsen等報道:切除大鼠牙齒的感覺神經會影響牙本質的生成，表明CGRP在牙本質形成過程中可能也具有一定的作用［9］。本研究顯示:CGRP在分泌型成釉細胞和成牙本質細胞中呈強陽性表達，與以上的研究結果相符，就此可以推測CGRP在釉質和牙本質礦化形成過程中可能具有一定的調控作用;再根據Gudermann等報道的CGRP可通過G蛋白偶聯受體影響細胞的分化、增殖和轉化［10］，因而也可推測CGRP在成釉細胞和成牙本質細胞中的表達可能對牙齒硬組織發育過程中細胞的增殖分化具有一定的意義，但仍需要進一步的研究探討。

［1］Caviedes－Bucheli J，Lombana N，Azuero－Holguín MM，et al.Quantification of neuropeptides(calcitonin gene－related peptide，substance P，neurokinin A，neuropeptide Y and vasoactive intestinal polypeptide)expressed in healthy and inflamed human dental pulp［J］.Int Endod J，2006，39(5):394 －400.

［2］李亞奇，宗穎，范小平.CGRP和NGF在正畸加力后人牙髓中的表達［J］.牙體牙髓牙周病學雜志，2010，20(8):441 －444.

［3］Amara SG，Jonas V，Rosenfeld MG，et al.Alternative RNA processing in calcit onin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products［J］.Nature，1982，15(298):240－244.

［4］鄭林豐，謝應桂，許愿忠.降鈣素基因相關肽在神經系統損傷中的作用［J］.創傷外科雜志，2006，6(8):571－573.

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［9］Jacobsen EB，Heyeraas KJ.Effect of capsaicin treatment or inferior alveolar nerve resection on dentine formation and calcitonin gene－related peptide and substance P immunoreactive nerve fibres in rat molar pulp ［J］.Arch Oral Biol，1996，41(12):1121－1131.

［10］Gudermann T，Grosse R，Schultz G.Contribution of receptor/G protein signalling to cell growth and transformation［J］.Arch Pharmacol，2000，361(4):345 －362.