喙尾琵琶甲提取物體外抗菌作用研究

施貴榮，莊孝龍，耿 玲，巫秀美，羅建蓉，劉光明

（大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

喙尾琵琶甲（ Blaps rynchopetera Fairmaire）屬鞘翅目（ Coleoptera）擬步甲科（ Tenebrionidae）琵琶甲屬（Blaps），是云南民間長期使用的昆蟲藥物，具有抗炎、抗菌、解毒等作用〔1〕。前期本課題組對喙尾琵琶甲乙醇提取物、水提取物、甲醇提取物進行了體外抗菌作用的研究，發現喙尾琵琶甲具有良好的體外抗菌作用〔2-3〕；為了進一步探討其抗菌作用部位，本課題組對喙尾琵琶甲的乙醇提取物進行了硅膠柱柱層析，將得到的不同極性組分進行體外抗菌活性篩選，確定喙尾琵琶甲的抗菌活性部位。

1 實驗材料

1.1 實驗藥材 樣品采集自大理市鳳儀鎮，經毛本勇教授（大理學院農學與生命科學學院）鑒定為喙尾琵琶甲。

1.2 供試菌株 白色葡萄球菌（S.albus）、金黃色葡萄球菌（ S.aureas）、變形桿菌（ P.vulgaris）、枯草桿菌（ B.subtilis）、白色念珠菌（ C.albicans）、甲型副傷寒沙門菌（S.paratyphi A）。以上菌株均由大理學院基礎醫學院微生物與免疫學實驗室提供。

1.3 培養基 水解酪蛋白瓊脂培養基（簡稱M-H瓊脂培養基）（杭州天和微生物試劑有限公司，批號070731）；細菌干粉培養基（簡稱M-H肉湯培養基）（杭州天和微生物試劑有限公司，批號070905）；液體沙氏培養基（北京奧博星生物技術有限責任公司，批號20090905）；沙氏瓊脂培養基（北京三藥科技開發公司，批號20091105）。

1.4 儀器 YXQ-LS-50S11型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；隔水式恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；R-210旋轉蒸發儀（ 瑞士BUCHI）；FD-1C-80冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 樣品制備 取喙尾琵琶甲全蟲，干燥后粉碎，加5倍體積的95%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液濃縮回收乙醇，得乙醇提取物；取500 g浸膏用80目硅膠拌樣，干法上硅膠柱，用不同極性溶劑依次洗脫，濃縮得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇五個組分；將6份樣品分別冷凍干燥低溫保存備用。

2.2 最低抑菌濃度的測定 采用常量試管稀釋法〔4-5〕測定喙尾琵琶甲提取物的最低抑菌濃度（MIC）。

2.2.1 菌液制備 從孵育10～12 h的非選擇性培養基上挑取3～5個菌落，直接用滅菌生理鹽水制成懸液并將濁度調至0.5麥氏比濁標準，相當于108CFU/mL的含菌量。 使用時用M-H肉湯稀釋（ 1∶10），稀釋后的菌液在15 min內接種。

2.2.2 藥物稀釋 取已處理好的無菌試管（15 mm×100 mm）14支，排成一排，每管加入M-H肉湯2 mL；在第1管中加入部位提取物（100 mg/mL）2 mL，混勻后取出2 mL至第2管，再次混勻后再取出2 mL至第3管，如此連續對比稀釋至第11管，最后從第11管中取出2 mL棄去，保證每管終體積為2 mL。第11、12、13、14管分別為藥物不加菌液對照、M-H肉湯對照、菌液對照和溶劑對照。此時各管藥物濃度依次為50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.195、0.098 mg/mL。

2.2.3 抑菌實驗 用M-H肉湯將調好的菌液作1∶10稀釋相當于含菌液量大約為107CFU/mL，除第11、12、14管不加菌液外，其余每管加入菌液0.1 mL。置于37℃恒溫培養箱中培養18～20 h后觀察結果。

2.2.4 結果判斷 在讀取試驗結果前，先觀察生長對照管的細菌生長情況是否良好，并檢查接種物的傳代培養是否污染。然后以肉眼觀察藥物最低濃度管無細菌生長者則為該藥物的MIC。再用微量加樣器取出管中溶液100 μL密集劃線轉種于M-H瓊脂平板或沙氏瓊脂平板上，繼續培養24 h，觀察無細菌生長或者細菌數小于5個的藥物最低濃度為最低殺菌濃度（ MBC）。

3 結果與討論

3.1 結果 由喙尾琵琶甲制備得到的6份樣品中，石油醚、氯仿、甲醇組分沒有體外抗菌作用，乙醇提取物、乙酸乙酯組分、丙酮組分對6種測試菌的MIC及MBC見表1～3。

表1 喙尾琵琶甲乙醇提取物對6種供試菌的MIC及MBC

表2 喙尾琵琶甲乙酸乙酯組分對6種供試菌的MIC及MBC

表3 喙尾琵琶甲丙酮組分對6種測試菌的MIC及MBC

由表1可看出，喙尾琵琶甲乙醇提取物對所選菌株有不同程度的抑菌作用，對白色葡萄球菌的作用最好，MIC為5.21 mg/mL；由表2可看出，乙酸乙酯組分對所選菌株也有不同程度的抑制作用，對白色葡萄球菌的作用最好，MIC為1.30 mg/mL，且乙酸乙酯組分的抑菌作用比乙醇提取物好；由表3可看出，丙酮組分除白色念珠菌外，對其他菌株都有不同程度的抑制作用，對白色葡萄球菌的作用最好，MIC為7.29 mg/mL。3次重復實驗結果基本一致。

3.2 討論 目前，抗生素在臨床應用最為廣泛，是人類防治感染性疾病最為重要的手段；但抗生素存在很多不良反應的問題，同時細菌耐藥性會引發醫院感染增加，臨床療效下降，甚至會出現無藥可選現象；而中藥與抗生素相比具有以下優點：①具備非特異性抗菌作用并能調節及提高機體免疫力；②不良反應小，在體內藥物殘留量低；③較少細菌對中藥產生耐藥。因此，進行天然藥物抗菌制劑開發是值得探索的研究方向，而我國的中醫文化和豐富的天然藥物資源為研究開發有效的抗菌制劑提供了最有利的保障〔6-7〕。

本研究通過體外抗菌實驗，篩選出喙尾琵琶甲的抗菌活性部位。從實驗結果可看出，喙尾琵琶甲乙醇提取物經硅膠柱柱層析后，石油醚、氯仿、甲醇組分沒有體外抑菌作用，而乙醇提取物、乙酸乙酯組分、丙酮組分都對所測菌株有一定的抑制作用，其中乙酸乙酯組分的抑菌作用最強，說明分離過程將抗菌活性組分富集到了乙酸乙酯組分。由此可得出以下結論：通過硅膠柱柱層析除去了乙醇提取物中沒有抑菌作用的成分；乙酸乙酯組分的抑菌作用明顯強于丙酮組分，所以乙酸乙酯組分為喙尾琵琶甲的體外抗菌活性組分；喙尾琵琶甲提取物對白色葡萄球菌抑制作用最好。

（本次實驗用的菌株由大理學院基礎醫學院微生物與免疫學實驗室提供，謹致謝意。）

〔1〕張蘭勝，夏從龍，楊永壽，等.彝藥喙尾琵琶甲的研究進展〔J〕.時珍國醫國藥，2009，20（ 12）：3113-3114.

〔2〕施貴榮，莊孝龍，孫會仙，等.喙尾琵琶甲抗菌活性的研究〔J〕.大理學院學報，2010，9（ 12）：18-19.

〔3〕施貴榮，肖培云，洪小鳳，等.喙尾琵琶甲提取物體外抗菌作用初步研究〔J〕.時珍國醫國藥，2011，22（ 3）：622-623.

〔4〕陳奇，卞如濂，陳修.中藥藥理研究方法學〔M〕.2版.北京：人民衛生出版社，2006，274-277.

〔5〕馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊〔M〕.北京：科學出版社，2001：210-212.

〔6〕陳勇川，謝林利，熊麗蓉，等.黃芩苷/黃芩素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗藥性的逆轉作用研究〔J〕.中國藥房，2008，19（ 9）：644-646.

〔7〕楊玉琴，姚楚水，馬繼周.中藥皮膚消毒劑殺滅微生物效果的試驗觀察〔J〕.中國消毒學雜志，2003，20（ 2）：92-94.