小鼠紫外線皮膚損傷模型的建立及T4N5給藥實驗

章偉韜，曹 宇，梅 翔，陳海容，范 開，

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院 ，重慶 400054;2.重慶富進生物醫(yī)藥有限公司，重慶 400041)

T4核酸內切酶 V(T4 endonuclease V，簡稱T4N5)是 T4噬菌體感染宿主 E.coli后由基因DenV表達的一種DNA修復酶。該分子含有138個氨基酸殘基，理論分子質量為16.0785 kDa。它能特異性地識別DNA胸腺嘧啶二聚體，并在該損失部位切斷磷酸二酯鍵，從而啟動體內的DNA切除修復途徑，從而有效防止紫外線輻射引起皮膚病變［1］。

脂質體是一種藥物載體新劑型，由磷脂、膽固醇等為膜材包合而成。脂質體可以將藥物粉末或溶液包埋在直徑為納米級的微粒中，這種微粒具有類細胞結構，在人體體表可以直接與細胞膜結合，從而提高上皮細胞對藥物的吸收度［2］。運用脂質體包埋的T4N5能夠有效穿透皮膚角質層，直達皮膚患處。

本實驗對T4N5抗紫外線損傷作用進行了動物學實驗研究。實驗使用的T4N5采用融合表達制備［1］，為脂質體凝膠。實驗動物為昆明小鼠，褪毛后皮膚暴露于固定強度的紫外線下照射，觀察對照組、模型組、給藥組和安慰劑組皮膚組織變化情況，并予以分析討論。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

動物:昆明小鼠32只，購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，7周齡，體質量40 g左右，雌性，按清潔動物標準條件分籠飼養(yǎng)。

主要儀器:UVB紫外線燈管，型號為TL20W/12RS，荷蘭PHILIPS公司生產(chǎn);紫外線照度計，型號為UV2000，杭州遠方光電信息有限公司生產(chǎn)。

實驗藥物:T4N5脂質體凝膠，委托重慶富進生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號20101104，蛋白濃度0.2 mg/mL，4℃保存;安慰劑脂質體凝膠，委托重慶富進生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號20101001，4℃保存。

1.2 實驗動物的造模

1.2.1 動物分組及前處理。昆明小鼠隨機分籠，分為4組:① 對照組;② 照射組;③ 安慰劑組;④照射給藥組。用苦味酸進行標記。在小鼠背部剪去體表長毛，用0.2 g/mL硫化鈉處理［3］，進行脫毛，脫毛區(qū)約為3.0 cm ×5.0 cm。

1.2.2 紫外線損傷模型的建立。除第①組外，對其余各組小鼠進行以下實驗:開啟UVB紫外線燈，預熱15 min，使光源發(fā)出的紫外線強度穩(wěn)定［4］;固定光源距小鼠背部距離約為25 cm，紫外線輻照度計測定輻照強度為0.35 mW/cm2;每天照射2次，每次照射30 min，間隔時間為12 h;實驗周期為10 d，總輻照量為12.6 J/cm2;照射期間停止給水給食，照射后0.5 h恢復。

1.2.3 實驗動物的飼養(yǎng)管理。所有小鼠按清潔動物標準條件分籠喂養(yǎng)，飼喂鼠顆粒飼料，飲水為滅菌生活飲用水。飼養(yǎng)溫度20～22℃，濕度50% ～60%，保持換氣通風［5－6］。實驗期間不進行自然采光，采用紅光照明，防止細胞 DNA光修復的發(fā)生［7］。

1.3 實驗動物的給藥

從第4 d照射起，第③組和第④組開始給藥，給藥時間為照射后15 min，給藥量為0.25 mL/次，給藥方式為外用，方法為用滅菌棉簽均勻涂抹于照射部位。

1.4 圖像采集

在第10 d最后一次實驗后，對所有小鼠脫毛區(qū)照射部位進行圖像采集。

1.5 組織學標本采集

圖片采集后，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射，麻醉小鼠，手術取下實驗照射部位皮膚，立即浸入10%福爾馬林中，固定24 h后取出，HE染色后浸蠟、包埋，然后切片［8］。

2 實驗結果

2.1 皮膚表面圖像分析

4組小鼠的皮膚情況(圖1):對照組小鼠皮膚光滑細膩，未見明顯病理性變化;照射組和安慰劑組小鼠表皮出現(xiàn)大面積紅斑，并且結痂皴裂、起皺;UVB照射給藥組小鼠皮膚光滑細膩，肉眼可見少量紅斑。

圖1 小鼠脫毛區(qū)照射部位圖像

2.2 組織學標本

HE染色切片(圖2)顯示:對照組、UVB照射給藥組小鼠皮膚較薄，真皮內主要細胞有成纖維細胞和巨噬細胞;UVB照射表皮及真皮層壞死，表皮層增厚，組織結構紊亂，皮脂腺及毛囊明顯減少，有局部增生，皮下組織水腫，伴有中性粒細胞浸潤。

圖2 小鼠脫毛區(qū)照射部位HE染色(10×40)

3 結束語

本研究表明，T4N5修復酶具有良好的修復皮膚紫外線損傷的能力，可有效減少了紫外線UVB造成的皮膚損傷。目前國內尚未有將T4N5修復酶應用于藥學和生物醫(yī)學方面的文獻報道。在國外，美國TPSG公司將T4N5包埋于脂質體中，作為護膚產(chǎn)品的主要成分;美國AGI公司開發(fā)的T4N5脂質體已在皮膚癌的預防和治療中進入III期臨床試驗［9］。隨著T4N5脂質體重組制備工藝的完善和成熟［1］，將其開發(fā)成修復紫外線所致的皮膚損傷的藥物或者化妝品將具有可觀的經(jīng)濟價值和臨床應用前景。

［1］范開，陳海容.融合表達重組制備T4核酸內切酶V［P］.中國專利，申請?zhí)?01010552859.5.

［2］楊彤.新型脂質體的研究進展［J］.醫(yī)藥導報，2009(3):336-338.

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［4］朱愉，多秀瀛.實驗動物的疾病模型［M］.天津:天津科技翻譯公司出版，1991:557-559.

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［9］Cafardi J A，Elmets C A.T4 endonuclease V:review and application to dermatology［J］.Expert Opinion on Biological Therapy，2008(6):829-838.