疊加對比氣相色譜法在中藥含量測定中的應用

徐國防 李 爽 紀 佳

（鄭州人民醫院，河南 鄭州 450003）

中藥包括中草藥和中成藥，在我國的應用已經有上千年的歷史，在世界上也受到了越來越多的關注和開發應用。過去，中藥的定量只要稱量一下藥材的重量即可，現在越來越需要測定出其中有效成分的精確含量，但中藥成分特別復雜多樣，在測定一些揮發性成分時，采用氣相色譜法常難以尋找到合適的內標。本文在疊加對比法理論[1]的基礎上，結合氣相色譜法的特點，設計了疊加對比氣相色譜測定中藥成分的試驗方案。

表1 線性回歸數據和最低檢測限

疊加對比法[1]，即在色譜圖中選取與待測成分色譜峰的保留時間和峰面積相近的穩定色譜峰作為參比峰（相當于內標峰），用待測成分峰面積與參比峰之比代替峰面積的絕對值的定量方法。計算公式如下：

式中：Ai為待測成分的峰面積；Ai′為增加待測成分純物質△mi后，再進樣，待測成分的峰面積；Ar為參比峰的峰面積；Ar′為增加待測成分純物質△mi后，再進樣，測得的參比峰的峰面積。

1 儀器與試藥

Agilent 6890N型氣相色譜儀配FID檢測儀（美國安捷倫公司）；ChemStation工作站（美國安捷倫公司）；BS110 S電子天平（德國Sartorius公司）；泌尿寧顆粒（自制，批號：20080901，20080923，20081009）；五味子甲素（批號：0764-200006）、五味子乙素（批號：0706-200003）均購自中國藥品生物制品檢定所；試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱為：HP-5 Phenyl Methyl Siloxane capillary column （30.0 m×0.32mm，0.50μm）；載氣：高純度N2；載氣流速：1.2mL/min；檢測器：氫焰離子化檢測器（FID）；燃氣為：氫氣（30mL/min）和空氣（300 mL/min）；檢測器溫度：280℃，進樣口溫度：230℃；進樣量：1μL；分流比：1∶50；升溫程序為：150 ℃維持3 min后，以10℃/min的速度升至210℃，接著以5 ℃/min的速度從210℃升至240℃，再以10 ℃/min的速度升至280℃，維持5min。在上述色譜條件下測定，各待測成分色譜峰、參比峰之間及與其他共存成分色譜峰之間能夠達到基線分離，各待測成分色譜峰、參比峰的理論塔板數均不低于3000。色譜圖見圖1A。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取泌尿寧顆粒12.0g，照《中國藥典》2010年版一部 附錄X D揮發油測定法提取，用正己烷萃取，再用無水硫酸鈉脫水處理后，用正己烷定容至25mL，得儲備供試液。將1.0mL儲備供試液用正己烷稀釋至10mL，用微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取五味子甲素、五味子乙素對照品適量，混合，用正己烷溶解，得到濃度分別為0.0600和0.240 mg/mL的混合儲備標準液。另取上述儲備供試液1.0mL，再加入1.0mL上述混合儲備標準液，用正己烷稀釋并定容至10mL，用微孔濾膜濾過，即得對照品溶液。

2.3 線性試驗

取已知含量的顆粒劑12g，精密稱定，置圓底燒瓶中，照“供試品溶液的制備”方法制成儲備供試液。精密量取5份該儲備供試液各0.5mL分別置于10mL的量瓶中，在其中4份溶液中依次加入0.5、1.5、2.5、3.5mL儲備標準液。將以上5份溶液加正己烷稀釋至刻度，混勻，進樣分析，每份兩針，記錄色譜圖，求每份樣品中待測成分峰面積與參比峰峰面積比的平均值，再將此峰面積比的平均值與溶液中待測成分的濃度進行線性回歸，結果見表1。逐步稀釋溶液，測定最低檢測限，結果見表1。

圖1 供試品溶液（圖A）和對照品溶液（圖B）色譜圖峰：1-五味子甲素；2-五味子乙素；3-參比峰

2.4 精密度和回收率試驗

取供試品溶液，重復進樣6次，記錄色譜圖，計算五味子甲素、乙素色譜峰峰面積與參比峰峰面積比的相對標準偏差。結果見表2。由表2可見方法的精密度良好。

表2 精密度測定試驗結果

取已知含量的泌尿寧顆粒樣品共9份，每份6.0 g，分別精密稱定，加入8.0，10.0，12.0mL混合儲備標準液各3份。將所得的9份樣品分別置于圓底燒瓶中，照上述方法制備供試品溶液和對照品溶液，測定加對照品后的含量。計算回收率（recovery）：

式中，mtotal是測得的總量，moriginal 是未加對照品時已知樣品中的含量，mspiked是加入的對照品的量。結果五味子甲素、五味子乙素的回收率分別為：96.7% （RSD 3.6%），99.3%（RSD 4.8%），表明方法的準確度基本良好。

2.5 樣品測定

取3批不同批號的樣品，按“供試品溶液的制備”和“對照品溶液的制備”項下操作制備供試品溶液和對照品溶液。在上述色譜條件下測定，分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各1μL，進樣測定，記錄色譜圖。分析供試品溶液色譜圖和對照品溶液色圖譜，選擇與待測成分色譜峰保留時間和峰面積相近的穩定色譜峰作為參比峰，按疊加對比法計算顆粒劑中五味子甲素等兩種成分的含量：

式中：mi為待測成分i的含量，單位mg?g-1；Ci為混合儲備標準液中i成分的濃度，單位mg?mL-1；Ai為供試品溶液待測成分（i）的峰面積，Ai′為對照品溶液i成分峰面積；Ar為供試品溶液參比峰的峰面積；Ar′為對照品溶液參比峰的峰面積；W為樣品稱樣量，單位g。測定結果見表3。

表3 樣品含量測定結果

3 討 論

疊加法的理論研究和應用較早[2,3]，但限于技術等原因，應用范圍不廣。隨著儀器分析技術的發展和復雜樣品分析工作的需要，疊加對比法開始應用于分析領域[4,5]，孫國祥教授等還對毛細管電泳疊加對比法的測定誤差進行了理論推導[6]。疊加對比法用相對峰面積替代了峰面積的絕對值，因此可以克服外標法中進樣量不準確、儀器波動等所帶來的定量誤差。該法還巧妙的利用了樣品中原有成分的色譜峰作為參比峰，避免了內標法在分析復雜樣品時較難找到合適的內標物或者色譜峰過于密集，無處可插入內標峰的困惑。總之，疊加對比法雖然不加內標物，卻具有內標法的優點，尤其適用于分析成分復雜的樣品，如中藥等。

根據參比峰的選擇原則，一般可以在進樣多次后選取與待測成分色譜峰的保留時間和峰面積相近且穩定的色譜峰作為參比峰。參比峰只需要在同一批測定供試品溶液和對照品溶液中保持相對的穩定（峰面積和保留時間的變化僅是由于進樣量不準確、儀器波動等偶然因素引起的，不包括參比成分不穩定等引起的變化）即可，而不必要在所有的樣品中均保持穩定。經過一定的試驗設計，甚至還可以選取不同的待測成分（即已知成分）色譜峰相互作為參比峰。

[1] 孫毓慶,王延琮.現代色譜法及其在藥物分析中的應用[M].北京：科學出版社,2005：279-280.

[2] 寇登民,云希勤,李艷紅,等.氣相色譜疊加定量方法的研究[J].分析化學,1992,20(5)：597-599.

[3] 王靜華,王宏偉.疊加定量氣相色譜法測定吹苯殘渣中的三苯含量[J].化學工程師,1997,3(60)：54-55.

[4] 孫國祥,苗菊茹,王宇,等.毛細管電泳疊加對比法測定阿片粉中嗎啡的含量[J].色譜,2002,20(1)：69-70.

[5] 孫國祥,孫毓慶,李陽,等.毛細管電泳疊加對比法測定復方降壓片中5組分含量[J].沈陽藥科大學學報,2002,19(4)：265-268.

[6] 孫國祥,鄧湘昱,萬月生,等.毛細管電泳疊加對比法的誤差分析[J].中南藥學,2004,2(5)：266-268.