妥布霉素生物合成中磷酸鹽的調節研究

劉 平

（丹東市食品藥品檢驗所，遼寧 丹東 118002）

在慶大霉素生物合成過程中，高濃度磷酸鹽阻遏從葡萄糖至2-DOS（2-脫氧鏈霉胺）之間的轉氨酶，從而影響產抗單位[1]。

妥布霉素（Tobramycin）屬第二代氨基糖苷類抗生素，作用于細菌30S核糖體亞基，抑制菌體蛋白質的合成，是廣譜高效力抗生素，在體外對多種細菌具有抗菌的活性，特別是對某些慶大霉素耐藥的綠膿桿菌活性更為顯著[2]。妥布霉素是黑暗鏈霉菌（S.tenebrariuys）發酵液中分離到的尼拉霉素（Nebramycin）復合物中的一個組分。尼拉霉素復合物其中主要組分為2、4、5′三個組分。組分5′為6”-O-氨甲酰妥布霉素（6”-O-Carbamoyltobramycin，CTB）。組分6（妥布霉素）可分別由組分4和組分5′經水解制得[3]。目前，國內妥布霉素產生菌主要產生組分2和組分5′兩個組分，由于提取、精制的步驟復雜，成本較高。為了提高菌株生產能力，降低妥布霉素生產成本，很多人已經在菌種選育方面作了大量工作，但是對于CTB生物合成的調節機制研究很少，本文初步探討了磷酸鹽調節CTB生物合成的作用機制。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑暗鏈霉菌201-420（S.tenebrariuys201-420），總效價1143U/mL，CTB百分含量88.5%；檢定菌：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis 63501）。

1.2 培養基（%）

1.2.1 斜面培養基

高氏一號種子培養基：葡萄糖1.0，黃豆粉1.0，蛋白胨0.3，玉米粉0.5，酵母粉0.1，CaCO30.1。

1.2.2 發酵培養基

黃豆粉4.0，葡萄糖4.0，蛋白胨1.0，CaCO30.5，MgSO4?7H2O 0.4，MnCl20.03，FeSO40.005，ZnSO40.003，NH4Cl 0.1%，豆油1.0。

1.2.3 鑒定培養基

蛋白胨0.5，牛肉膏0.3，K2HPO4 0.3，瓊脂2.2，pH 7.8～8.0。

1.3 效價測定方法

二劑量法（中國藥典2005年版）

1.4 細胞破碎方法

將發酵液離心收集菌體，洗滌，置-70°C冰箱反復凍融3次，用超聲波破碎儀破碎菌體。

2 實驗結果與討論

2.1 37h補加磷酸鹽對發酵效價的影響

見圖1。由圖1可以看出，37h補加低濃度磷酸鹽時，有促進產生抗生素的作用，而當最終的作用濃度達到0.1%以上的時侯，效價就會顯著下降。磷酸鹽對各種抗生素合成的調節有不同的機制。所以，在下面的實驗中，作者考察了磷酸鹽調節CTB生物合成一種可能的機制。

2.2 高濃度磷酸鹽阻遏從2-脫氧肌醇到2-DOS之間的轉氨酶2-DOS是氨糖類抗生素重要的生物合成中間體，從葡萄糖至2-DOS的生物合成途徑中，如圖2，葡萄糖首先轉變成為2-脫氧肌醇，然后再經過兩次氧化、氨基化作用，轉變成為2-DOS[4]。根據報道，在慶大霉素生物合成的過程中，高濃度的磷酸鹽阻遏了從葡萄糖到2-DOS之間的L-谷氨酰胺：青蟹-肌醇單酮轉氨酶。因而影響氨基化作用，進而影響產生抗生素[3]。在以下的實驗中，我考察了在CTB的生物合成過程中是否也存在相同的作用機制。

圖1 37h補加磷酸鹽對發酵效價的影響

2.3 高濃度磷酸鹽與氯霉素作用效果比較為了考察高濃度磷酸鹽的負調控作用是通過阻遏某種酶的合成還是抑制某種酶的活性，我比較了高濃度的磷酸鹽與氯霉素的作用效果，因為氯霉素是蛋白質合成抑制劑，發酵37h，同時向發酵液中添加一定濃度的氯霉素和高濃度的磷酸鹽，若兩者對CTB生物合成的作用效果一致，則表明磷酸鹽是通過阻遏某種酶的合成而影響抗生素的合成。結果如圖2所示。由圖2中可以看出，氯霉素對菌體的生長沒有影響。可氯霉素和高濃度磷酸鹽對CTB生物合成的作用效果基本一致，這表明磷酸鹽是通過阻遏CTB生物合成過程中的某個酶的合成而起作用的。

圖2 高濃度磷酸鹽與氯霉素作用效果比較

2.4 高濃度磷酸鹽阻遏從2-脫氧肌醇到2-DOS之間的轉氨酶 為了考察磷酸鹽具體阻遏了CTB生物合成過程中哪一個步驟，我在發酵37hr，向發酵液中添加11.6 mmol/L的磷酸鹽，使抗生素的合成被抑制，并且在發酵73h，加入不同濃度由葡萄糖到2-DOS之間幾種可能的前體物質或中間體。由表1看出：只有73h，加入30mmol/L以上的氨基葡萄糖。由此，可以推測同慶大霉素一樣磷酸鹽阻遏了。

表1 Specific antibiotic produced by phosphate repress cultures supplementedwith precursors and intermediates of the CTB biosynthetic pathway

3 結 論

通過上面的實驗，我們可以得出下面的結論：在發酵過程中加入5.75mmol/L以上磷酸鹽，對CTB的生物合成發生明顯的負調控作用。其原因可能是：磷酸鹽本身阻遏L-谷氨酰胺：青蟹-肌醇單酮轉氨酶的合成。從而影響了從葡萄糖合成2-DOS的氨基化作用。

[1] Obregon AM.Physioloical studies on getamicin：Phosphate repression of antibiotic formation[J].J Antibiotics,1994,47(12)：1442-1446.

[2] 張淑華,李蓉以,廖勇.國產妥布拉霉素和阿普拉霉素對綠膿桿菌體外抗菌活力的研究[J].抗生素,1986,11(3)：239.

[3] Koch,K.Nebramycin：seperation of the complex and identification of factor 4,5and 5’,J[J].Antibiotics,1973,26(12)：745-751.

[4] Rinehart KL Jr,Malik JM,Nystrom RF,et al.Biosynthetic incorporation of [1-13C] glucosamine(*)and [6-13C] glucose into neomycin,J[J].Am Chem.Soc,1974,96(5495)：2263-2265.