膠原性關節炎大鼠血清中TNF-α，IL-17及IL-10水平分析

宋 光，裘紅梅

(大連大學醫學院檢驗系，遼寧大連 116622)

膠原性關節炎大鼠血清中TNF-α，IL-17及IL-10水平分析

宋 光，裘紅梅

(大連大學醫學院檢驗系，遼寧大連 116622)

［目的］檢測血清TNF-α，IL-17及IL-10在Ⅱ型膠原誘導性關節炎(CIA)大鼠血清中的表達。［方法］建立CIA動物模型，用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)法檢測大鼠模型血清中炎性細胞因子TNF-α、IL-10及IL-17的水平，同時觀察大鼠炎癥指數。［結果］60只大鼠隨機被分為造模組(40只)和對照組(20只)，免疫4周后，造模組40只大鼠有32只發病。造模成功組大鼠血清中TNF-α、IL-17水平分別為(39.65±11.23)pg/mL和(46.1±10.9)pg/mL，明顯高于造模失敗組和正常對照組(P均＜0.05)，而IL-10水平(29.11±27.59)pg/mL明顯低于造模失敗組和正常對照組(P＜0.05)。另外，造模組大鼠血清TNF-α和IL-17水平與CIA大鼠炎癥指數呈正相關關系(r=0.573，r=0.492，P＜0.05)，與之相反，CIA大鼠血清 IL-10水平與炎癥指數呈負相關關系(r=-0.481，P＜0.05)。［結論］致炎因子(TNF-α，IL-17)和抑炎因子(IL-10)表達失衡可能在CIA發病中具有重要作用。

膠原性關節炎;TNF-α;IL-17;IL-10;關節炎癥指數

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關節滑膜炎為特征，以慢性、對稱性、多發性關節炎為主要臨床表現的一種自身免疫性疾病。迄今為止RA發病機制尚未完全闡明，但很多研究表明RA動物模型在關節炎癥早期存在抑炎癥因子水平的降低及致炎癥因子水平的升高［1-2］，即炎癥因子的失衡與RA炎癥過程有密切關系。本實驗建立Ⅱ型膠原誘導型關節炎(CIA)大鼠模型，檢測其血清中TNF-α，IL-17和IL-10水平，并觀察其與炎癥指標的相關性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑

Wistar大鼠60只，清潔級動物，雌性，4～6周齡，體重為(160±15)g，購于大連醫科大學實驗動物中心。許可證號為SCXK(遼)2002-0002。卡介苗(長春生物制品研究所產品);羊毛脂(中國嘉定華亭羊毛脂廠產品);牛Ⅱ型膠原(typeⅡcollagen，CⅡ，美國Sigma公司產品)。檢測大鼠血清中TNF-α，IL-17及IL-10水平的ElISA試劑盒(BioLegend公司)。

1.2 動物造模

60只大鼠隨機分成兩組:模型組40只，正常對照組20只。具體造模如下:弗氏完全佐劑的配制［3］:將液體石蠟和羊毛脂(2∶1)于70℃水浴中充分混勻，高壓滅菌(121℃、30 min)制成弗氏不完全佐劑，4℃保存。使用時，將減毒卡介苗80℃ 滅活，與弗氏不完全佐劑混勻，制成弗氏完全佐劑，卡介苗的終濃度為10 mg/mL。將牛CII溶于0.05 mol/L乙酸，并與等體積弗氏完全佐劑混合制成混懸乳劑，CII終濃度2 mg/mL。造模組大鼠每只尾根部皮內注射200 μL上述乳劑，1周后，每只大鼠接受加強免疫，尾根部皮內注射乳化CII 100 μL，誘發 CIA。對照組大鼠以相同劑量相同部位注射生理鹽水。

1.3 關節炎癥指數評定

采用關節分數評分法記錄多發性關節炎病變的發生及嚴重程度，CIA關節炎癥的嚴重程度按照以下評分標準進行，分數越高，病情越重。每個肢體最高分為4分，每只大鼠最高分為16分，記分標準分5級(0～4)，具體標準如下［4］:0分:無關節炎;1分:關節輕度腫脹;2分:關節部位中度腫脹;3分:嚴重腫脹;4分:嚴重腫脹且不能負重。

1.4 血清TNF-α、IL-17及IL-10水平的檢測

大鼠心臟采血，離心取上清-20℃保存備用。檢測血清TNF-α、IL-10、IL-17水平，具體操作按ELISA試劑盒說明進行。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 一般觀察

正常對照組大鼠后腿，可觀察到其表面顯現正常的粉紅色，腳踝無腫脹，足趾不增厚。在免疫8～12 d后，模型組大鼠開始出現癥狀。發病大鼠后腿可見腳踝明顯腫脹，足趾明顯增厚，整個后腳呈現紅色或粉紅色斑點。嚴重者可見紫色，且行走不便，不能負重。紅腫逐漸消退逐漸出現關節強直、畸形以至功能障礙，表明慢性、對稱性、多發性關節炎發生。40只免疫大鼠中，有32只發病明顯;而對照無發病大鼠。發病大鼠活動量明顯減少，食欲下降，體重低于正常組。

2.2 各組大鼠關節炎癥指數評定

造模成功組關節炎指數與對照組和造模失敗組比較，差異具有統計學意義(P＜0.05)。關節炎指數隨時間延長逐漸增高，免疫4周及3周較免疫后10 d關節炎癥更明顯，差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表 1。

表1 不同組大鼠炎癥指數的比較Tab 1 The comparison of inflammatory index in rats from different groups (±s)

表1 不同組大鼠炎癥指數的比較Tab 1 The comparison of inflammatory index in rats from different groups (±s)

1)與免疫3周及4周時比較，P＜0.05;2)與造模失敗組及正常對照組比較，P＜0.05

組別 n 免疫后10 d 免疫3周 免疫4周造模成功組 32 4.5 ±2.11)2)9.6 ±2.3 10.4 ±1.2造模失敗組 8 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0正常對照組20 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0

2.3 各組大鼠血清細胞因子水平的測定

在免疫后的第4周，大鼠心臟穿刺采血，離心取上清，檢測大鼠血清TNF-α，IL-17和IL-10的表達水平。與造模失敗及正常對照組相比，造模成功組大鼠血清中TNF-α，IL-17的水平顯著增高(P＜0.05);IL - 10水平明顯降低(P ＜0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠血清TNF-α，IL-17和IL-10水平的比較Tab 2 the comparison of TNF-α，IL-17 and IL-10 in rats serum from different groups (±s)

表2 兩組大鼠血清TNF-α，IL-17和IL-10水平的比較Tab 2 the comparison of TNF-α，IL-17 and IL-10 in rats serum from different groups (±s)

1)與造模失敗組及正常對照組比較，P＜0.05

組別 TNF-α(pg/mL) IL-17(pg/mL) IL-10(pg/mL)造模成功組 39.65 ±11.231) 46.1 ±10.91) 29.11 ±27.591)造模失敗組 14.33 ±4.78 5.1 ±1.2 58.78 ±15.75正常對照組10.49 ±8.53 4.2 ±1.6 59.00 ±16.85

2.4 CIA大鼠血清TNF-α，IL-17和IL-10水平與炎癥指數的相關性分析

免疫4周后，造模組大鼠血清TNF-α和IL-17水平與CIA大鼠炎癥指數呈正相關關系(r=0.573，r=0.492，P 均 ＜0.05)，與之相反，CIA 大鼠血清IL-10水平與炎癥指數呈負相關關系(r=-0.481，P ＜0.05)。

3 討 論

RA是以關節滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，致殘率高。基本病理改變是滑膜炎和血管翳形成及血清組織中多種細胞因子及黏附分子等變化。其中細胞因子異常產生及其相互作用在RA關節軟骨和骨質破壞過程中起重要作用。細胞因子根據其性質可分為兩大類，即促炎細胞因子和抑炎細胞因子。在正常情況下，促炎因子和抑炎因子處于一個平衡狀態，如有外界原因使促炎因子增加而抑炎因子的分泌減少，打破這種平衡，則會引發關節炎癥。RA患者外周血單核細胞和關節滑膜液的巨噬細胞能分泌TNF-α，在關節炎癥、滑膜新生血管形成及骨質破壞等病變發展中起主要作用。研究表明，TNF-α能啟動和維持RA炎癥免疫，在RA發病中起著中心環節的作用［5］。TNF-α單克隆抗體已經成功應用于RA患者。IL-17主要由活化的T細胞產生，促進滑膜細胞分泌多種細胞因子，具有強大的致炎作用能刺激成纖維細胞分泌 IL-6、IL-8、GM -CSF等炎癥因子［6］。抑制軟骨細胞合成基質，增強破骨細胞活性，與TNF-α協同參與骨侵蝕。IL-10是重要抗炎TH2型細胞因子，通過抑制核因子κB進而抑制Th1細胞產生TNF -α、IL -2、IFN -γ［7］;可下調抗原遞呈細胞功能，抑制基質金屬蛋白酶生成，抑制IL-17等致炎因子的功能和生成，從而抑制RA關節炎炎癥，控制或阻止軟骨及骨的破壞。

由Ⅱ型膠原誘導的實驗性關節炎動物模型是研究人類RA的常用模型，本實驗40只造膜組大鼠有32只關節腫脹程度嚴重，隨著時間的推移炎癥指標逐漸加重，說明造模成功。本實驗發現，在關節炎大鼠血清中致炎因子TNF-α、IL-17明顯升高;抑炎因子IL-10表達顯著受抑;并且增高的TNF-α和IL-17與炎癥指數呈正相關關系，而降低的IL-10水平與炎癥指數呈負相關，說明關節炎大鼠發病過程中，細胞因子網絡失調發揮重要作用，并與炎癥發病有關。本研究提示對細胞因子深入研究將有助于進一步認識RA的發生機制，合理地評價RA的病情進展，為RA的免疫治療提供科學的理論依據。

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［1］周厚清，吳瑾濱，董敏.類風濕因子陰性類風濕關節炎患者血清抗瓜氨酸肽或蛋白抗體、IL-10及IL-18檢測分析［J］.國際檢驗醫學雜志，2011，32(13):1441-1442.

［2］Somers K，Geusens P，Elewaut D，et al.Novel autoantibody markers for early and seronegative rheumatoid arthritis［J］.J Autoimmun，2011，36(1):33 -46.

［3］Lars Klareskog，Hugh Mc Devit.Rheumatoid arthritisand it＇s animal models:the role of TNF - and the possible absenceof specific immune reactions［J］.Curr Opin Immunol，1999，1(11):657 - 662.

［4］李霞，趙彩紅，裘紅梅.膠原性關節炎大鼠血清中IL-17 水平的分析［J］.中國現代醫學雜志，2009，19(14):2135-2137.

［5］Petrovi- Rackov L.Evaluation of the degree of clinical rheumatoid arthritis activity based on the concentrations of cytokines TNF-alpha，IL-12，IL-15，and IL-18 in serum and synovial fluid ［J］.Vojnosanit Pregl，2006，63(1):21-26.

［6］Ghilardi N，Ouyang W.Targeting the development and effectorfunctions of TH17 cells［J］.Semin Immunol，2008，19(6):383- 393.

［7］范雪亮，肖金魚.關節炎大鼠模型血清中IL-4、IL-10表達的檢測［J］.中國中醫急癥，2011，20(7):1102，1127.

Analysis of TNF-α，IL-17 and IL-10 levels in the serum of rats with collagen-induced arthritis

SONG Guang，QIU Hong-mei
(Medical Laboratory Technology，Dalian University Medical School，Dalian116622，China)

Abstract:［Objective］To investigate the serum levels of TNF-α，IL-17 and IL-10 in rats with type II collagen-induced arthritis(CIA).［Methods］The rat model was established using type II collagen and the serum levels of TNF - α，IL-17 and IL-10 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The arthritis index in CIA rats were observed.［Results］Sixty rats were randomized into two groups:modeling group(40 rats)and normal control(20 rats).After 4 weeks，the models of CIA were established in 32 rats.The serum levels of TNF-α and IL-17 in the successful modeling group were(39.65 ± 11.23)pg/mL and(46.1 ± 10.9)pg/mL，respectively，significantly higher than that in the abortive modeling group and normal control.While serum concentration of IL -10(29.11 ±27.59)pg/mL in the successful modeling group was remarkably lower than that in the abortive modeling group and normal control(P＜0.05).In addition，There were positive correlations between TNF - α，IL -17 and arthritis index(r=0.573，r=0.492，P＜0.05)，negative correlations between IL -10 and arthritis index in CIA rats(r= -0.481，P＜0.05).［Conclusion］The imbalance of pro- inflammatory cytokine(TNF-α，IL-17)and anti-inflammatory cytokine(IL-10)network may be playing an important role in the pathogenesis of CIA.

Key words:collagen-induced arthritis;TNF-α;IL-17;IL-10;arthritis index

R392-33

A

1671-7295(2012)05-0492-03

遼寧省高等學校科研項目計劃(L2010021)

2012-06-13;

2012-09-09

宋 光(1970-)，女，講師，碩士。

裘紅梅，高級實驗師，碩士。E-mail:yxyqhm@126.com