口腔扁平苔蘚中MMP-2和MMP-9的表達及意義

浦光瑞，張 虹

(大連醫科大學附屬第一醫院口腔科，遼寧大連 116011)

口腔扁平苔蘚中MMP-2和MMP-9的表達及意義

浦光瑞，張 虹

(大連醫科大學附屬第一醫院口腔科，遼寧大連 116011)

［目的］探索MMP-2和MMP-9與口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)的發生、發展乃至癌變潛能的關系。［方法］采用免疫組化SP法檢測MMP-2和MMP-9在22例OLP、11例正常口腔黏膜組織、22例白斑和22例口腔鱗癌組織表達。［結果］在正常口腔黏膜、扁平苔蘚、白斑和鱗癌組織中MMP-2和MMP-9的表達依次增加。MMP-2和MMP-9在口腔扁平苔蘚和白斑中的表達顯著高于正常口腔黏膜 (P＜0.05)，但在口腔扁平苔蘚和白斑間的表達差異無顯著性意義(P＞0.05);在鱗癌中的表達顯著高于其他3組 (P＜0.05)。［結論］MMP-2和MMP-9表達與OLP的發生、發展乃至癌變潛能有關。

基質金屬蛋白酶2;基質金屬蛋白酶9;扁平苔蘚;口腔

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)是發生在口腔黏膜的一種慢性、淺表性炎癥損害，因其長期糜爛有惡變傾向，WHO將其列入癌前狀態，癌變率在1%左右［1］。其病因和癌變原因目前仍不明了。臨床對于判斷OLP是否發生癌變主要依靠光鏡下的形態學標準，因此從分子水平上探尋有助于判斷病變組織良惡性程度的標記物已成為口腔醫學研究的熱點。基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinase，MMPs)能夠特異性的降解基底膜的成分。基底膜中最主要的穩定成分是Ⅳ型膠原，只有Ⅳ型膠原酶能降解Ⅳ型膠原，破壞基底膜的完整性。MMPs中的明膠酶是惟一能夠降解細胞外基質(extracelluar matix，ECM)和基底膜(basement membrane，BM)中IV型膠原的酶，它包括MMP-2和MMP-9，其作用底物幾乎覆蓋了所有基底膜成分，是研究基底膜損傷最重要的一組酶［2］。本實驗采用免疫組化法，檢測MMP-2和MMP-9在OLP中的表達，并用正常口腔黏膜(normal oral mucosa，NOM)、白斑(oral leukoplakia，OLK)和口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)作對照，研究MMP -2和MMP-9與OLP的發生發展乃至癌變潛能的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

選取大連醫科大學附屬第一醫院口腔科2009—2010年經病理科確診的22例OLP患者的病變黏膜組織為研究對象，以11例NOM(腫瘤邊界1 cm外的癌旁組織來源于拔牙患者、外傷患者和唇腭裂患者)，22例OLK和22例OSCC對照。患者均知情同意。

1.2 實驗試劑

兔抗人基質金屬蛋白酶2多克隆抗體和兔抗人基質金屬蛋白酶9多克隆抗體(中杉金橋試劑公司);快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物(福州邁新生物技術開發有限公司產品);檸檬酸組織修復液(福州邁新生物技術開發有限公司產品);DAB顯色試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司產品)

1.3 實驗方法

組織經10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，10 μm厚連續切片。3%雙氧水孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶的活性，1%檸檬酸于高壓鍋內抗原熱修復2 min，5%正常牛血清孵育15 min以阻斷非特異背景反應;滴加一抗，室溫孵育60 min;滴加即用型快捷免疫組MaxVision試劑，室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，封片。

1.4 結果判定

采用獨立雙盲法觀察結果，用PBS代替一抗作為陰性對照。染色陽性以細胞漿或胞膜呈現棕黃至棕褐色為標準，按半定量方法判定其表達強度(按照參照文獻［3］進行評分)。根據細胞著色強度分為:無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分;每張切片隨機選擇10個400倍視野計算細胞總數和陽性表達的細胞個數，得出細胞表達百分率:無陽性細胞為0分，陽性細胞數占1% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，﹥75%為4分。兩項結果相加:0～2分為陰性，≥3分者為MMP-2和MMP-9陽性。

1.5 統計學方法

應用SPSS12.0統計軟件。各組陽性率差異比較采用行×列χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

MMP-2在NOM染色較淺大多呈陰性表達;OLP和OLK中在上皮基底層陽性表達;在OSCC陽性表達顯著增強，在基底膜附近的腫瘤細胞和癌巢染色更為明顯，癌巢周圍間質也有中等程度的染色(表1、圖1)。MMP-9在NOM染色較淺大多呈陰性表達;OLP中主要在上皮基底層陽性表達，還有少量在固有層的炎性浸潤細胞陽性表達;OLK中在上皮基底層陽性表達;在OSCC陽性表達顯著增強，在基底膜附近的腫瘤細胞和癌巢染色更為明顯，癌巢周圍間質也有中等程度的染色(表2、圖2)。

表1 MMP-2在NOM、OLP、OLK和OSCC中表達的細胞數比較Tab 1 The expression of MMP -2 in NOM、OLP、OLK and OSCC in cell number comparison (n)

表2 MMP-9在NOM、OLP、OLK和OSCC中表達的細胞數比較Tab 2 The expression of MMP -9 in NOM、OLP、OLK and OSCC in cell number comparison (n)

在OLP、OLK、OSCC中 MMP-2和 MMP-9的表達依次增強，且與NOM比較差異均有顯著性意義(P＜0.05)。OLP和OLK兩組之間比較差異無顯著性意義(P＞0.05)，但與OSCC比較差異均有顯著性意義(P ＜0.05)。

3 討 論

基底膜改變是OLP病損的特征學改變，損傷的基底膜一旦失去了支撐作用，基底細胞就會脫落，導致發生基底細胞的液化變性，因此基底膜的損傷在口腔扁平苔蘚發病中有很重要作用。Ⅳ型膠原是基底膜中最主要成分，其數量減少或功能異常時可影響基底膜的生理功能及細胞功能，也是腫瘤細胞浸潤擴散過程中的一道天然屏障［4］。

本研究中MMP-2和MMP-9在NOM有很少量表達，并與OLP差異有顯著性意義(P＜0.05)。這可能是一種正常生理狀態下的持續弱陽性表達，正常組織通過嚴格調控MMP-2和MMP-9基因的正常表達來維持與它們各自的特異性抑制劑TIMP-2和TIMP-1之間的平衡，從而使基底膜的合成和降解達到了平衡穩定狀態［5］。

MMP-2和MMP-9在OLP中的陽性表達低于OLK，這與OLP沒有上皮異常增生而OLK有上皮異常增生的病理特征相吻合。但兩組間差異無顯著性意義，原因可能是實驗樣本例數不足或選取的OLK組織異常增生的程度較輕。從OLP、OLK至OSCC中MMP-2和MMP-9的陽性表達率依次增加，說明兩者在有異常增生上皮組織中的表達強于無異常增生組織(OLK和OSCC高于OLP)，且隨著異常增生程度的加重而表達增強。MMP-2和MMP-9在OLP的陽性表達介于NOM和OSCC之間，并且差異有顯著性意義，說明口腔扁平苔蘚尚未進展到癌，但仍具有一定的癌變傾向，這為解釋臨床上大多數口腔扁平苔蘚生物學行為較好，僅有極少部分病例不斷發展甚至癌變提供了一定的理論依據。

本實驗在OLP中MMP-9的陽性細胞還有少部分在炎性浸潤的黏膜固有層中表達，其原因可能有兩點:一是抗原特異性的CD8+T淋巴細胞可以分泌MMPs和它們的抑制劑(tissue Inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)，在OLP固有層的炎性浸潤組織中，兼有MMP-9和TIMP-1mRNA表達能力的T細胞在受到細胞因子的刺激后，使 T細胞表達MMP-9mRNA的水平升高，而TIMP-1則缺乏這種變化，導致MMP-9與TIMP-1之間平衡失調，因MMP-9相對于TIMP-1的過表達，使TIMP-1抑制MMP-9的作用減弱，從而MMP-9的降解作用增強。二是MMP-9激活以后，降解了的基底膜，還可以使更多的T細胞沿著基底膜缺損處進入上皮而加劇上皮基底膜的損傷［6］，T細胞穿過基底膜的遷移活動和T細胞衍生的MMPs有關。Smllor等［7］實驗證明浸潤的T淋巴細胞可以引起基底膜的損傷，損傷的基底膜又可以加重扁平苔蘚的病理改變。Sugerman等［8］認為抗原特異性和非特異性機制均可引起基底膜的損傷，兩種機制的共同歸宿就是MMPs引起基底膜的損傷。由此推測T細胞來源的MMP-9可能參與了OLP的發病。

有研究表明角質形成細胞需要基底膜衍生細胞的存活信號來阻止細胞凋亡的發生。因此推測本實驗中在MMP-2和MMP-9導致OLP上皮基底膜的破壞之后，損壞的基底膜無法提供生存信號給角質形成細胞，從而繼發角質形成細胞的細胞凋亡，而凋亡的角質形成細胞分泌基底膜結構蛋白的能力大大降低，不能修復受損基底膜，使基底膜的損傷加劇。所以，基底膜的損傷與其繼發引起的角質形成細胞凋亡，兩種過程相互促進，導致OLP的慢性進程。

本實驗中MMP-2和MMP-9在OSCC的陽性表達顯著高與其他3組，其原因可能是在OSCC中MMP-2和MMP-9在腫瘤細胞和間質細胞中均有分布，并在癌巢周邊表達明顯增多，提示癌巢邊緣細胞增生活躍，能誘導MMP-2和MMP-9的產生，降解細胞外基質和癌巢基底膜，因而具有較高的侵襲潛能;但在OLP和白斑中主要定位于上皮細胞中，間質細胞表達很少，提示MMP-2和MMP-9的激活是參與細胞癌變的因素之一，當細胞癌變后，腫瘤細胞能分泌或誘導間質細胞分泌大量的MMP-2和MMP-9，破壞基底膜和細胞外基質的降解平衡，從而促進癌細胞突破基底膜和細胞外基質構成的組織學屏障，侵襲周圍組織和深層組織，重新塑造局部微環境［9］，達到侵襲和轉移的目的。Jordan等［10］曾報道MMPs可能是口腔上皮異常增生惡性轉化的一個有用指標，其可能的機制是MMP和P53的突變存在聯系。

本研究提示，MMP-2和MMP-9在OLP中的表達上調是其發生發展乃至癌變的分子基礎，MMP-2和MMP-9的水平變化有可能成為扁平苔蘚的診斷、預后和判斷癌變的動態指標之一。此外TIMPs可以抑制MMPs的活性，在正常生理狀態下MMPs與TIMPs協同產生而維持動態平衡，但當此平衡被打破時，ECM和BM的代謝異常可導致疾病的發生并促進惡化。

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［5］李文薈，郭莉，譚耀文，等.口腔癌及癌前病變組織中MMP-9基因表達的意義［J］.臨床口腔醫學雜志，2007，23(1):27 -28.

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［10］Jordan RC，Macabeo-Ong M，Shiboski CH，et al.Overexpression of matrix metalloproteinase-1 and-9 mRNA is associated with progression of oral dysplasia to cancer［J］.Clin Cancer Res，2004，10:6460 -6465.

Expression and significance of oral lichen planus in MMP-2 and MMP-9

PU Guang-rui，ZHANG Hong
(Department of Stomatology，the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116011，China)

Abstract:［Objective］To Explore the relationshiops of MMP-2 and MMP-9 to the OLP occurrence，the development and even the canceration potential.［Methods］Immunohisto- chemistry was performed to examine expressions of MMP -2 and MMP -9 in 22 OLP，11 normal oral mucosa，22 oral leukoplakia and 22 squamous cell carcinoma.［Results］The expression of MMP-2 and MMP-9 increased in turn from normal oral mucosa to OLP，oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma tissues.The expression of MMP-2 and MMP-9 in OLP and oral leukoplakia was significantly higher than that in normal oral mucosa(P＜0.05)，there was significant difference;There was no significant difference between the positive expression of MMP-2 and MMP-9 in OLP and oral leukoplakia(P＞0.05);The expression of MMP-2 and MMP-9 in squamous cell carcinoma was significantly higher than The other three groups(P＜0.05)，there was significant difference.［Conclusion］The expression levels of MMP-2 and MMP-9 correlate with the occurrence of oral lichen planus，development and even cancer potential，which may be useful indicator to judge the possibility of malignant change of OLP.

Key words:matrix metalloproteinase-2;matrix metalloproteinase-9;lichen planus;oral

R781.5+9

A

1671-7295(2012)05-0446-04

2012-04-18;

2012-08-10

浦光瑞(1982-)，女，遼寧大連人，主治醫師。E-mail:puguangruiliu@sina.com