骨基質(zhì)明膠在異位成骨區(qū)的成骨研究

王瑞芳 秦書(shū)儉 田志逢

1.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院基礎(chǔ)部解剖教研室，山西汾陽(yáng) 032200；2.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001；3.漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校解剖教研室，河南漯河 462002

骨折愈合是一個(gè)受多因素影響的復(fù)雜過(guò)程，其中骨折區(qū)的血液供應(yīng)對(duì)骨折愈合的效果起到非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究不同處理后的骨基質(zhì)明膠 （bone matrix gelatin，BMG）在兔股前內(nèi)側(cè)區(qū)的成骨效果，為臨床骨折修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康5月齡日本大耳白兔40只，體重1.5～2.0 kg，雌雄不限。

1.2 制備BMG

取4只日本大耳白兔四肢骨、髂骨，將四肢骨的骺端及髂骨參照Urist[1]的方法制備成6 mm×5 mm×4 mm大小的BMG。

1.3 BMG的植入

將36只日本大耳白兔隨機(jī)分為3組，10%水合氯醛腹腔麻醉后手術(shù)，在膝關(guān)節(jié)上方的股內(nèi)側(cè)區(qū)做一縱行切口，A組：BMG用2 μg/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）浸泡過(guò)后將隱動(dòng)、靜脈游離 1 cm后順行植入；B組：將隱動(dòng)、靜脈游離1 cm后植入未作任何預(yù)處理的BMG中；C組則直接將未處理過(guò)的BMG植入，不分離隱動(dòng)、靜脈。術(shù)后肌內(nèi)注射4 萬(wàn)U慶大霉素，1次/d，共注射7 d。

1.4 血管灌注

術(shù)后4、8、12周，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取各組動(dòng)物4只，10%水合氯醛腹腔麻醉后仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，暴露腹主動(dòng)脈和下腔靜脈，結(jié)扎腹主動(dòng)脈近心端，在其遠(yuǎn)心端做離心插管，往動(dòng)脈內(nèi)注入大量肝素生理鹽水同時(shí)剪開(kāi)下腔靜脈，直至靜脈遠(yuǎn)端流出清亮、透明、無(wú)色液體時(shí)為止。然后從腹主動(dòng)脈注入配好的復(fù)合墨汁，觀察血管化情況，至下腔靜脈有墨汁回流，遠(yuǎn)端皮膚、甲下顏色變黑時(shí)結(jié)扎下腔靜脈，繼續(xù)灌入少量復(fù)合墨汁。放置24 h后取出植入物，再放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h。

1.5 HE和Masson染色組織學(xué)觀察及定量分析

將固定好的植入物行脫鈣、脫水、冬青油透明后石蠟包埋、作縱橫切片，厚度為5 μm，隨后進(jìn)行HE染色和Masson染色，倒置顯微鏡下觀察血管化及成骨情況。根據(jù)體視學(xué)德萊塞原理，參照空間內(nèi)某特征物的面積分?jǐn)?shù)是其體積分?jǐn)?shù)的估計(jì)，以Masson染色組織片中新生骨及血管的面積比來(lái)代表新生骨及血管化水平，在每個(gè)蠟塊標(biāo)本的上、中、下部分分別作連續(xù)橫向切片5 片，置于顯微鏡下，在CIAS-1000 細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)下測(cè)算其新生骨面積比及血管面積比。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組別之間作方差分析，多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；作新生骨面積比和血管面積比的線性相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)用r表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察

術(shù)后4周，A組移植物中央有少量的血管 （圖1，見(jiàn)封三），B、C組的血管集中在材料邊緣。術(shù)后8周，A、B組移植物中央血管量增加，其中A組增加較B組多，兩組支架材料已經(jīng)開(kāi)始降解吸收，在新生的血管周?chē)梢?jiàn)新生軟骨組織（圖2～3，見(jiàn)封三），C組無(wú)新骨形成。術(shù)后12周，A組材料大部分被新生軟骨和骨組織代替，新生血管排列較有序，B組新生血管趨向于有序排列（圖4，見(jiàn)封三），C組材料由大量纖維結(jié)締組織充填，新生血管集中在材料邊緣，并且排列紊亂。

2.2 新生骨面積定量分析

移植物新生骨面積比如表1 所示。表1 中可以看出，術(shù)后4周，A、B組與C組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）；術(shù)后8周，A、B、C組之間互相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；術(shù)后12周，A、B組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

表1 移植物新生骨面積比比較（±s，%）

表1 移植物新生骨面積比比較（±s，%）

注：同一時(shí)間點(diǎn)與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，△P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

?

2.3 新生骨面積比與血管化面積比相關(guān)分析結(jié)果

新生骨面積與血管面積圖像相關(guān)分析結(jié)果見(jiàn)圖5，r4周=0.53，P＜0.05；r8周=0.46，P＜0.05；r12周=0.61，P＜0.05。 表明新生骨面積比與血管面積比呈正相關(guān)。

3 討論

有研究表明，組織工程骨的成骨效果受局部血運(yùn)的影響，局部的血管化有助于組織工程骨的成骨，說(shuō)明局部好的血運(yùn)對(duì)成骨具有重要的意義[2]。

血液循環(huán)的建立，是一切成骨機(jī)制的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)新生骨面積和血管化面積相關(guān)分析可以看出，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)新生骨面積比與血管化程度均呈正相關(guān)，血管化程度越高，新生骨面積越大。王永剛等[3]認(rèn)為組織工程骨中央植入的血管束可以促發(fā)多中心成骨，不同于僅依靠周?chē)苤饾u向材料中心長(zhǎng)入，隨血管的長(zhǎng)入而向心性成骨的單一漸進(jìn)性過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了這種多中心成骨現(xiàn)象，其機(jī)制可能是血管束植入帶入的細(xì)胞在一定條件下可轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，促進(jìn)了移植物的成骨過(guò)程。骨性結(jié)構(gòu)在崩解的過(guò)程中，形成了骨形態(tài)發(fā)生蛋白調(diào)控因子[4]。移植物的成骨過(guò)程，可能通過(guò)膜性化成骨和軟骨化成骨兩種過(guò)程相輔相成得以實(shí)現(xiàn)。

Leunig等[5]研究發(fā)現(xiàn)，體外環(huán)境下，bFGF抑制軟骨細(xì)胞的分化。體內(nèi)環(huán)境中，由于bFGF的促血管化作用，對(duì)新骨的形成有促進(jìn)作用。在異位成骨中，bFGF可以通過(guò)增加新生血管的形成改善血供條件[6-7]。本實(shí)驗(yàn)中A組成骨效果好于B組，可能是因?yàn)锳組中加入的bFGF的促血管化作用加速了新生骨的形成。

細(xì)胞支架材料是組織工程學(xué)組織的基礎(chǔ)[8-10]。研究表明所用材料的性能和孔隙比促血管形成的生長(zhǎng)因子對(duì)血管生長(zhǎng)的影響更大。Pieper等[11]認(rèn)為生物材料良好的生物相容性減少了異物反應(yīng)，他們認(rèn)為異物反應(yīng)過(guò)程中炎癥細(xì)胞的作用和植入物表面形成的纖維包膜不利于血管的長(zhǎng)入。本實(shí)驗(yàn)新生骨面積分析可見(jiàn)A、B、C三組在術(shù)后12周時(shí)的面積比均比同組8周時(shí)小，分析其原因可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)所用的支架材料BMG是同種異體材料，生物相容性好，所以容易被降解吸收，隨著血管化程度的不斷增高，新生骨也不斷地吸收改建，其吸收的速度大于新骨形成的速度，最終導(dǎo)致術(shù)后12周時(shí)新生骨面積比比術(shù)后8周時(shí)為小。金大地等[12]認(rèn)為BMG在脫鈣的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)一系列處理，除去了磷蛋白、脂蛋白和蛋白多糖等大量非骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）物質(zhì)，再經(jīng)過(guò)冷凍處理，使其免疫原性降低，相對(duì)而言，BMP的純度相應(yīng)提高，而B(niǎo)MG的膠原結(jié)構(gòu)變得松散，容易被宿主吸收，使周?chē)律芗八拗骷?xì)胞容易長(zhǎng)入也是誘導(dǎo)成骨作用明顯的一個(gè)重要原因。在本實(shí)驗(yàn)新生骨面積比和血管化面積比的相關(guān)分析中也可以看出，血管化程度越高，新生骨面積越大，這和金大地等人的研究結(jié)果是一致的。

雖然BMG作為支架材料具有上述諸多優(yōu)點(diǎn)，但是實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)BMG存在吸收過(guò)快的問(wèn)題，如果要應(yīng)用于臨床還需要進(jìn)一步改變生物學(xué)性狀，減慢其吸收速度。

[1] Urist MR.Bone： formation by autoinduction [J].Science，1965，150（698）：893-899.

[2] 金丹，陳濱，裴國(guó)獻(xiàn)，等.筋膜瓣促組織工程骨再血管化及山羊長(zhǎng)段骨缺損的修復(fù)[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2005，22（3）：269-271.

[3] 王永剛，裴國(guó)獻(xiàn).血管束植入在組織工程骨血管化構(gòu)建中的作用[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2007，32（1）：26-28.

[4] Aldinger G，Herr G，Kusswetter W.Bone morphogenic protein：a review[J].Inter Orthop，1991，15（2）：169.

[5] Leuning M，Yuan F，Gerweck LE，et al.Effect of basic fibroblast growth factor on angiogenesis and growth of isografted bone：quantitative in vit-ro-in vito analysis in mice[J].Int J Microcirc Clin Exp，1997，17（1）：1-9.

[6] Wiltfang J，Merten HA，Wilrfang J.Ectopic bone formation with the help of growth factor bFGF [J].J Craniomaxillofac Surg，1996，24 （5）：300-304.

[7] Radomsky ML，Thompson AY.Potential role of fibroblast growth factor in enhancement of fracture Healing [J].Clin Orthop，1998，355 Suppl：S283-293.

[8] Kuboki Y，Jin Q，Takita H.Geometry of carriers controlling phenotypic expression in BMP-induced osteogenesis and chondrogenesis[J].J Bone Joint Surg Am，2001，83-A（Suppl 1）：S105-115.

[9] Pu LL，Holme KR，Symes JF．Heparinase enhances collateral vessel development in the ischemie limb[J]．Int Surg，2002，87（4）：260-268．

[10] Philippe P，Villars F，Mathoulin-Pelissier S.Influences of vascularization and osteogenic cell on heterotopic bone formation within a madreporic ceramic in rats [J].Plast Reconstr Surg，2003，111 （6）：1932-1941.

[11] Pieper JS，van Wachem PB，van Luyn MJA，et al.Attachment of glycosaminoglycans to collagenous matrices modulates the tissue response in rats[J].Biomaterials，2000，21（6）：1689-1699.

[12] 金大地，區(qū)伯平，邵振海，等.骨基質(zhì)明膠的制備及其臨床應(yīng)用38例報(bào)告[J].中華外科雜志，1991，29（5）：312-314.