扁平苔蘚中早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1和腫瘤壞死因子-α的表達(dá)及意義

鄧磷君，白 莉

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科，山西太原 030001

扁平苔蘚（lichen planus，LP）是一種慢性炎癥性疾病，累及皮膚黏膜，發(fā)病機(jī)制尚無(wú)定論。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在其發(fā)病中有著重要作用。有學(xué)者認(rèn)為腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在扁平苔蘚角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用，國(guó)內(nèi)外研究表明，早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1（Egr-1）可以上調(diào)TNF-α的表達(dá)[1-2]。本研究通過(guò)檢測(cè)Egr-1、TNF-α在扁平苔蘚皮損處的表達(dá)，探討它們?cè)诒馄教μ\發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在我院皮膚科就診的30例患者，均經(jīng)臨床和病理確診為扁平苔蘚，其中，男18例，女12例；年齡15～70歲，平均41.5歲；半年內(nèi)未使用過(guò)激素、免疫調(diào)節(jié)劑治療。對(duì)照組30例均為我院整形科和普外科的正常人，其中，男16例，女14例；年齡22～69歲，平均44歲；無(wú)任何皮膚病及系統(tǒng)性疾病。兩組性別和年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有皮損和正常皮膚組織均經(jīng)甲醛固定石蠟包埋備用。

本課題已經(jīng)倫理委員會(huì)討論通過(guò)，且所有患者自愿簽署了知情同意書(shū)。知情同意書(shū)內(nèi)容主要包括：本課題研究時(shí)間為2010年6月～2011年3月；對(duì)患者的隱私進(jìn)行保密；本實(shí)驗(yàn)的研究目的為進(jìn)一步探討參與LP的發(fā)病原因，為治療該疾病提供有效依據(jù)；如患者受到因本實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致的損失，筆者則加以賠償；患者在了解上述內(nèi)容后自愿填寫(xiě)同意書(shū)。

1.2 試劑

TUNEL原位凋亡檢測(cè)試劑盒及二步法PV-6001 免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司；兔抗人Egr-1多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)公司；兔抗人TNF-α多克隆抗體由武漢博士德生物技術(shù)公司提供。

1.3 方法

1.3.1 TUNEL原位凋亡檢測(cè)法 石蠟標(biāo)本連續(xù)切片；37℃烘烤過(guò)夜；常規(guī)二甲苯脫蠟；梯度酒精水化；蒸餾水沖洗，加3%的H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，20μg/ml蛋白酶K37℃修復(fù)15 min，滴加TdT及FITC標(biāo)記的核苷酸混合反應(yīng)液37℃ 75 min，后滴加轉(zhuǎn)換劑POD液37℃30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。用不含TdT酶，只含標(biāo)記dUTP的溶液代替TUNEL反應(yīng)液作為陰性對(duì)照。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法 采用PV6001 二步法：石蠟標(biāo)本連續(xù)切片；常規(guī)二甲苯脫蠟；梯度酒精水化；蒸餾水沖洗，加3%的H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；在枸櫞酸鈉緩沖液中高壓加熱（Egr-1 加熱 2 min，TNF-α 加熱 30 s）進(jìn)行抗原修復(fù)；滴加一抗（Egr-1 濃縮液 1∶300 稀釋?zhuān)琓NF-α 濃縮液 1∶200 稀釋?zhuān)灰訮BS代替一抗作為陰性對(duì)照，37℃孵育 1 h；滴加二抗PV6001，37℃孵育 15 min，DAB 顯色；蘇木素復(fù)染，封片。

1.4 結(jié)果判定

TUNEL原位凋亡檢測(cè)結(jié)果以顯微鏡下細(xì)胞核有棕黃色顆粒為陽(yáng)性。免疫組織化學(xué)結(jié)果以細(xì)胞漿和（或）細(xì)胞核有棕黃色顆粒為陽(yáng)性，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用MIAS-2000 圖像分析系統(tǒng)分析陽(yáng)性區(qū)域積分光密度值（IOD值），以IOD值的大小代表陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)的多少。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，指標(biāo)間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUNEL檢測(cè)結(jié)果

LP皮損表皮中大量角質(zhì)形成細(xì)胞 （尤以液化變性的基底細(xì)胞層為多）和真皮淺層浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞呈陽(yáng)性染色；而正常皮膚組織中僅有個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)凋亡；陰性對(duì)照中未見(jiàn)陽(yáng)性結(jié)果。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果

LP皮損中Egr-1 的陽(yáng)性表達(dá)重要分布于表皮全層的角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮淺層浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞核和胞漿中（以胞核為主），TNF-α陽(yáng)性表達(dá)分布于相同部位的細(xì)胞漿中；而在正常皮膚組織中均呈陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)。兩者在扁平苔蘚組和對(duì)照組中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （Egr-1：t=6.410，P<0.05；TNF-α：t=7.585，P<0.05），扁平苔蘚組中 Egr-1 和 TNF-α的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.896 7，P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1、腫瘤壞死因子-α在扁平苔蘚和正常皮膚組織中的表達(dá)水平（±s，μg/L）

表1 早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1、腫瘤壞死因子-α在扁平苔蘚和正常皮膚組織中的表達(dá)水平（±s，μg/L）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

扁平苔蘚組對(duì)照組組別例數(shù)30 30 Egr-1 11.296 ±3.316*7.076 ±1.343 TNF-α 12.996 ±3.761*7.399 ±1.482

3 討論

LP是一種慢性皮膚黏膜疾病，至今發(fā)病機(jī)制尚未明確。細(xì)胞凋亡在LP發(fā)病中有著十分重要的作用。多項(xiàng)研究指出淋巴細(xì)胞參與介導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度凋亡可能是導(dǎo)致LP發(fā)病的重要機(jī)制，且其皮損中的膠樣小體即為凋亡小體[3]。本研究結(jié)果顯示，LP皮損處凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于正常皮膚組織，證明了細(xì)胞凋亡的異常在LP發(fā)病中的作用有著十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)中凋亡細(xì)胞主要分布于表皮基底層和真皮淺層，且在相同部位檢測(cè)到Egr-1、TNF-α大量表達(dá)，表明Egr-1 和TNF-α可能是通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生參與LP的發(fā)病。

Egr-1 是含有3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，是即刻反應(yīng)基因（immediate-early gene）的產(chǎn)物[4]。其基因廣泛存在于從酵母到人類(lèi)的真核細(xì)胞基因庫(kù)中，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激、炎癥等細(xì)胞外刺激而引起膜去極化時(shí)，原本處于休眠狀態(tài)的即刻反應(yīng)基因通過(guò)絲裂原激活蛋白激酶（MAPKs）轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活[5]，轉(zhuǎn)導(dǎo)合成Egr-1 蛋白。 有研究表明，多種細(xì)胞因子的編碼基因啟動(dòng)子中都存在著功能性Egr-1 的結(jié)合位點(diǎn)，包括增殖分化、細(xì)胞凋亡、炎癥因子趨化等相關(guān)基因[6]。Egr-1 通過(guò)與基因啟動(dòng)子上的位點(diǎn)結(jié)合，可調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，參與相應(yīng)生物學(xué)作用的發(fā)生。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Egr-1 在LP中的表達(dá)明顯高于正常皮膚組織，這與劉麗等[7]的研究結(jié)果相一致，由此推測(cè)Egr-1 的高表達(dá)可能參與LP的發(fā)病。

皮膚中的TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞、激活的T淋巴細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，不僅參與免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，還可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，LP皮損中TNF-α表達(dá)明顯高于正常皮膚組，這與王娟等[8]的研究結(jié)果一致，表明TNF-α在基底層和真皮淺層的高表達(dá)可能參與了LP的發(fā)病。LP皮損中CD8+T細(xì)胞占真皮淺層浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞的絕大多數(shù)，其可在局部釋放細(xì)胞因子，通過(guò)死亡受體和穿孔素途徑介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡。目前研究表明，死亡受體途徑可能通過(guò)T淋巴細(xì)胞分泌的TNF-α、FasL與角質(zhì)形成細(xì)胞表面的TNFR、Fas相結(jié)合，激活Caspase酶系的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[9]，從而誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡。

近年來(lái)有研究表明，Egr-1 可以上調(diào)TNF-α的表達(dá)水平[1]。本研究結(jié)果提示，Egr-1 與TNF-α的表達(dá)呈正相關(guān)，再次證明Egr-1 對(duì)TNF-α表達(dá)可能有促進(jìn)作用。因細(xì)胞受到胞外刺激而轉(zhuǎn)錄合成的Egr-1 可能與TNF-α編碼基因啟動(dòng)子上的位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)了TNF-α的表達(dá)水平。有學(xué)者通過(guò)利用Egr-1 反義寡核苷酸（AS-ODN）抑制Egr-1 的表達(dá)，觀察到大鼠缺氧心肌細(xì)胞TNF-α表達(dá)明顯減少，證明了Egr-1對(duì)TNF-α的可能的誘導(dǎo)作用[2]。

因此筆者認(rèn)為，Egr-1 可能通過(guò)上調(diào)TNF-α的表達(dá)，經(jīng)由CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，從而參與了LP的發(fā)病。

[1] 郭曉林，姜雅秋，遲保榮.EGR-1 在重癥胰腺炎中的作用[J].中國(guó)老年醫(yī)學(xué)雜志,2008,3(28):215-216.

[2] 高萍.Egr-1 反義寡核苷酸對(duì)大鼠心肌細(xì)胞Egr-1 蛋白表達(dá)及缺氧/修復(fù)損傷的影響[D].汕頭:汕頭大學(xué)出版社,2006.

[3] Weedon D.Civatte bodies and apoptosis[J].Br J Dermato,1974,91(3):357.

[4] Khachigian LM.Early growth response-1 in cardiovascular pathbiology[J].Circ Res,2006,98(2):186-191.

[5] 崔文,孔靈玲,肖蘭,等.乳腺癌耐藥性中MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與EGR-1 關(guān)系的研究[J].濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,32(1):1-3.

[6] Blaschke F， Bruemmer D， Law RE.Egr-1 is a major vascular pathogenic transcription factor in atherosclerosis and restenosis[J].Rev Endocr Metab Disord,2004,5(3):249-254.

[7] 劉麗，臧磊，呂曉丹,等.Egr-1 在口腔扁平苔蘚及口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,32(2):204-206.

[8] 王娟，白莉.扁平苔蘚中TNF-α和TNFRⅠ的表達(dá)及意義[J].實(shí)用醫(yī)雜志,2008,15(31):4342-4343.

[9] Sugerman PB，Savage NW，Walsh LJ，et al.The pathogenesis of oral lichen planus[J].Crit Rev Oral Bio Med,2002,13(4):350-365.