參知健腦膠囊對Beagle犬的急性毒理研究

馬大勇，韓振蘊，范吉平

1.北京中醫藥大學附屬東直門醫院腦病科，北京 100700；2.北京中醫藥大學附屬東方醫院腦病科，北京 100078；3.中國中醫科學院，北京 100700

參知健腦膠囊是以王永炎院士提出的血管性癡呆 “正虛毒損絡阻”創新病因病機學說為指導研發而來[1-4]，主要由人參、知母、赤芍等藥物提取物按一定比例優化配伍而成[5]，具有扶正通絡解毒的功效[6-7]，是國家重大新藥創制項目的候選新藥。

本研究旨在觀察參知健腦膠囊對Beagle犬的急性毒理反應，為臨床前反復給藥的毒性研究及臨床安全用藥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

參知健腦膠囊由北京中醫藥大學中藥學院提供，批號：20100907。

1.2 實驗動物

5～7個月齡普通級Beagle犬6只，雌雄各半，體重：雌性5.85～6.68 kg，雄性 6.45～7.47 kg，由北京瑪斯生物技術有限公司提供，合格證號：0165269。

1.3 動物飼養與管理

在北京昭衍新藥研究中心有限公司普通級動物房飼養，所有動物購入后，由獸醫負責檢疫，檢疫馴養期15 d；飼料由北京科澳協力飼料有限公司生產；動物飲用水為符合國家生活飲用水衛生標準的自來水，用飲水盆供應，外觀和細菌指標每月檢測一次；不銹鋼材料籠具，規格為長×寬×高＝1 250 mm×800 mm×900 mm，單籠飼養；動物房設定的溫度范圍是18～26℃，實測溫度范圍是18～23℃，設定的濕度范圍是40%～70%，實測濕度范圍是29%～66%，光照12 h明暗交替。除實驗方案規定的禁食時間外，每只動物每天上午和下午各喂食1次，每次喂食150 g左右，動物自由攝水；籠具每天沖洗1次，動物房地面和墻面每周消毒1次，用0.1%新潔爾滅或0.5%的84 消毒液擦拭消毒，兩種消毒液交叉使用。

1.4 動物分組

采用區段隨機法分組，即按性別將動物分成雌雄兩個區段，然后用Excel軟件給出每個動物的隨機數，之后將隨機數從小到大進行排序，將比格犬分為3組，每組雌雄各1只。

1.5 藥物配制

根據給藥前最近1次的動物體重，計算各組動物的給藥量。稱取適量供試品，用滅菌注射用水溶解。溶解后的供試品常溫條件下保存使用。

1.6 給藥劑量及方法

首次給藥劑量、給藥濃度、給藥容量見表1。

表1 第1次灌藥劑量

由于中、高劑量組動物藥后半小時左右嘔吐，嘔吐物顏色與給予的供試品相似，考慮給藥量不能達到實驗設計要求。此外，低劑量組動物沒有嘔吐，考慮動物嘔吐可能與藥物濃度較高有關。所以，在首次給藥2 d后，對中、高劑量組動物進行了第2次給藥，并對給藥容量和藥物濃度進行了相應的調整，具體見表2：

表2 第2次灌藥劑量

灌胃給藥，低劑量組動物給藥1次，中、高劑量組動物給藥2次。動物灌胃前禁食過夜，藥后再禁食約1 h。灌胃給藥時，使用20 ml一次性注射器準確抽取所需溶液，用16 號灌胃管經口灌胃給藥，每只動物給藥完畢后給予約10 ml飲用水沖洗胃管。

1.7 檢測指標

1.7.1 臨床觀察

一般臨床觀察內容：籠旁觀察動物死亡或瀕死情況、精神狀態、行為活動、進食情況、糞便形狀等；詳細臨床觀察內容：精神狀態、行為活動、皮膚、被毛、眼、耳、鼻、口腔、腹部、外生殖器、肛門、四肢、足和呼吸等。

1.7.1.1 給藥當天 給藥后籠旁觀察，1 h內連續觀察，每隔15 min記錄1次，1～4 h內至少每隔1 h觀察1次；對未出現明顯異常反應的動物，4 h后結束觀察；對出現明顯異常表現的動物，進行1次詳細臨床觀察，部分動物藥后5 h結束觀察。給藥當天的籠旁觀察和詳細臨床觀察均記錄在同一張記錄表中。

1.7.1.2 其他時間 觀察時間：檢疫馴養期每天1次一般臨床觀察；給藥后次日開始，每天上午和下午各進行1次一般臨床觀察，第7 天和第14 天進行詳細臨床觀察，觀察期為14 d。在同一時間段，一般臨床觀察與詳細臨床觀察不重復實施。

1.7.2 生命體征

1.7.2.1 體重 給藥前、給藥后第7 天和第14 天稱重，每次稱重均在上午喂食前進行。

1.7.2.2 體溫 給藥前、藥后4～5 h、第7 天和第14 天測量體溫。

1.7.2.3 心電圖 測定時間：給藥前、藥后4～5 h、第7 天和第14天，心電指標包括心率、P-R間期、Q-T間期和QRS時限。

1.7.3 血液學檢查

給藥前、給藥后第7 天和第14 天三個時點取血，動物前肢皮下靜脈取血；血常規血樣用EDTA-2K抗凝，用Bayer Advia 2120 全自動血球分析儀測定；血凝血樣用枸櫞酸鈉1∶9 抗凝，分離血漿，使用MC-4Plus四通道血凝儀測定，用光學比濁法；血生化血樣不抗凝，取血后2 h內分離血清。使用TBA-120FR型全自動生化分析儀和Medica Easylyte型全自動電解質分析儀測定。

1.7.3.1 血常規 包括紅細胞計數網織紅細胞計數、血紅蛋白、紅細胞容積、平均紅細胞血紅蛋白、平均紅細胞體積、平均紅細胞血紅蛋白濃度、血小板計數、白細胞計數、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞。

1.7.3.2 血凝 包括凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）。

1.7.3.3 血生化 天門冬氨酸氨基轉換酶（AST）、丙氨酸氨基轉換酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、肌酸磷酸激酶（CK）、尿素氮 （BUN）、 肌 酐 （Cr）、 總 蛋 白 （TP）、 白 蛋 白 （ALB）、 血 糖（GLU）、 總膽紅素 （TBil）、 鉀離子濃度 （K+）、 鈉離子濃度（Na+）、氯離子濃度（Cl-）。

1.7.4 眼科檢查

給藥前以及給藥后第14 天行眼科檢查。檢查方法為通過肉眼或檢眼鏡觀察動物的眼瞼、結膜、鞏膜、角膜、前房、虹膜、瞳孔、晶體、玻璃體和眼底有無明顯異常。

1.7.5 病理檢查

所有動物實驗結束后均進行大體解剖，發現任何組織器官體積、顏色、質地等肉眼可見的病變時，記錄并將有異常改變的組織器官取材并固定于10%中性福爾馬林溶液中，制片并進行組織病理學檢查。

1.8 動物麻醉及安樂死方法

觀察期結束（給藥后第15 天）時，用濃度為30 mg/ml的戊巴比妥鈉溶液，按30 mg/kg的劑量靜脈注射麻醉動物，直至動物進入無意識狀態后，股動脈快速放血，將動物安樂死。

1.9 數據處理方法

將不同組別及同一組動物給藥前后的體重、體溫、心電圖、血液細胞計數、凝血功能和血液生化等指標直接進行比較，綜合評價。

2 結果

2.1 不同組別給藥后的臨床觀察

試驗期間，沒有發現動物死亡或瀕死。低劑量組（1000mg/kg）2只動物未見異常反應；中、高劑量組的4只動物臨床反應主要是藥后出現嘔吐和稀便，藥后次日至觀察期結束未見異常反應。

2.2 不同組別給藥前后體重的變化

試驗期間，各劑量動物的體重均呈增長趨勢，增長幅度未見明顯異常。見表3。

表3 不同組別給藥前后體重的變化（kg）

2.3 不同組別給藥前后體溫的變化

試驗期間，各劑量組動物的體溫基本在正常參考值范圍內波動，未見與藥物相關的規律性變化。

2.4 心電圖

試驗期間，各劑量組動物的心電參數在動物正常參考值范圍內波動，未見明顯異常改變。

2.5 血液學

2.5.1 不同組別給藥前后血細胞計數的變化

試驗期間，各劑量組動物的血細胞計數在動物正常參考值范圍內波動，未見有規律性的明顯異常改變。見表4。

2.5.2 不同組別給藥前后凝血功能的變化

試驗期間，各劑量組動物的凝血功能指標未見有規律性的明顯異常改變。見表5。

2.5.3 不同組別給藥前后血液生化量的變化

試驗期間，各劑量組動物的血液生化指標在正常參考值范圍內波動，未見有規律性的明顯異常改變。見表6。

2.6 眼科檢查

各劑量組動物的眼瞼、結膜、角膜、虹膜、鞏膜、前房、瞳孔、晶狀體、玻璃體和眼底均未見異常改變。

2.7 病理學檢查

所有動物大體解剖觀察，各組織臟器均無肉眼可見異常改變。

表4 不同組別給藥前后血細胞計數的變化

2.8 影響研究可靠性和造成研究工作偏離實驗方案的異常情況

試驗期間，飼養室設定濕度范圍為40%～70%，實測濕度范圍為29%～66%，其中有部分時間段濕度超過設定的下限，最長時間不超過1.5 h。由于偏離的時間較短，在此期間未見動物因濕度的變化出現相關的異常表現，故認為此項偏離不影響試驗結果的可靠性。此外，未見影響研究可靠性和造成研究工作偏離實驗方案的其他異常情況。

表5 不同組別給藥前后凝血功能的變化

3 討論

Beagle犬灌胃給予參知健腦膠囊，當給藥劑量為2000mg/kg及以上劑量時，可見動物出現嘔吐和稀便；給藥劑量為1 000 mg/kg時，未見異常反應。2 000 mg/kg劑量組動物共給藥2次；第1次給藥容量與1 000 mg/kg劑量組相同，藥物濃度為1 000 mg/kg劑量組2 倍；第2次給藥容量為1 000 mg/kg劑量組的2 倍，藥物濃度與1 000 mg/kg劑量組相同。該組動物2次給藥后均發生嘔吐，嘔吐反應發生時間為藥后30～40 min，提示動物藥后嘔吐與給藥劑量相關。

第2次給藥后，由于動物嘔吐，高劑量組2只動物的實際給藥劑量為2 209 和3 092 mg/kg。由于中、高劑量組動物的實際給藥劑量均大于2 000 mg/kg，且兩組動物藥后均可見到稀便，而1 000 mg/kg劑量組動物未見該反應，提示動物稀便與給藥劑量相關。

中、高劑量組動物藥后次日動物即恢復正常，嘔吐和稀便為一過性反應。試驗期間，這兩組動物的體重、體溫、心電圖、血液學、血液生化、眼科和大體解剖等檢查均未見明顯異常，表明在本試驗條件下，Beagle犬灌胃給予2 000 mg/kg的供試品，耐受性較好。

表6 不同組別給藥前后血液生化量的變化

在本試驗條件下，參知健腦膠囊灌胃給予Beagle犬，安全劑量為1 000 mg/kg，最大耐受量（MTD）大于3 000 mg/kg。

[1] 王永炎.關于提高腦血管疾病療效難點的思考[J].中國中西醫結合雜志,1997,17(2):195-196.

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[3] 李澎濤,王永炎,黃啟福.“毒損腦絡”病機假說的形成及其理論與實踐意義[J].北京中醫藥大學學報,2001,24(1):1-6.

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[5] 楊傲然,田昕,鐘華,等.參知健腦片有效組分的最佳配伍篩選[J].中華中醫藥學刊,2009,27(12):2600-2602.

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