P16和Bcl-2蛋白在鼻咽部鱗狀細胞癌的表達及相互關系

陳洪昌 張惠琴 陳建軍 李國疆 李文華

1.成都市新都區人民醫院耳鼻喉科，四川成都 610500；2.貴陽醫學院附屬醫院耳鼻喉科，貴州貴陽 550004

鼻咽癌（nasopharyngeal carrinoma，NPC）是東南亞地區，尤其是中國南方高發惡性腫瘤之一，在我國南方其發病率居耳鼻咽喉科惡性腫瘤之首，但其發病機制尚未明確。近年來，從分子水平對癌基因和抑癌基因與腫瘤關系的研究日益增多。P16 即多發性腫瘤擬制基因，其蛋白可與細胞周期素cyclinD1 競爭性結合CDK4 和CDK6，并特異性地抑制CDK4的活性，阻止細胞進入S期和DNA合成的啟動[1]。P16 在cyclinD-CDK4/6-PRb-E2F細胞周期調節途徑中起負反饋作用，一旦P16 基因發生變異，上述環路無限制進行下去，最終導致腫瘤的發生。bcl-2 即B細胞淋巴瘤/白血病基因2，屬于參與凋亡調控的基因家族。Bcl-2 在線粒體上可直接調節膜上的通透性轉換孔來調節線粒體膜的通透性，以阻止細胞色素C釋放入胞質而抑制細胞凋亡[2]。本課題用免疫組化方法研究鼻咽癌和鼻咽慢性炎癥黏膜組織中P16 和Bcl-2 蛋白的表達情況，從而分析P16 和Bcl-2 蛋白在鼻咽癌發病機制中所起的作用以及兩者的相關性，以期為臨床診斷、治療鼻咽癌，降低鼻咽癌復發率提供新的理論依據和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取2010年3月～2010年6月于我院經耳鼻咽喉科活檢、資深病理科醫師確診且病歷資料完整的40例鼻咽部鱗狀細胞癌患者的鼻咽部組織蠟塊，并隨機選取同期確診為鼻咽部慢性炎癥的患者組織蠟塊16例。40例鼻咽部鱗狀細胞癌患者中，男36例，女4例；高分化癌2例，中分化癌4例，低分化癌34例；有頸部淋巴結轉移18例，無頸部淋巴結轉移22例。

1.2 方法

采用免疫組化SP法檢測P16 和Bcl-2 蛋白的表達情況。免疫組化染色按SP試劑盒說明書進行，采用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。主要步驟包括：切片、脫蠟、梯度酒精水華，抗原修復、孵化、DAB顯色、蘇木素復染、封片觀察[3]。

1.3 判定標準

顯微鏡下觀察P16 和Bcl-2 蛋白的表達情況。免疫組化染色陽性細胞觀察標準：細胞核或細胞質內出現有棕黃色顆粒判斷為陽性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，當理論頻數＜1 時采用Fisher確切概率法，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鼻咽鱗狀細胞癌組織中P16 蛋白表達與組織分化程度的關系

從表1 中可以看出，P16 蛋白的缺失與鼻咽部鱗狀細胞癌的分化程度有著密切的關系，P16 蛋白多見于高分化組織中（χ2=8.682，P＜0.05）。P16 在鼻咽鱗狀細胞癌組織中的陽性表達情況，見圖1。

表1 鼻咽鱗狀細胞癌組織中P16蛋白表達與組織分化程度的關系（例）

圖1 P16 陽性表達的免疫組化圖（×400）

2.2 鼻咽鱗狀細胞癌組織中P16 蛋白表達與頸部淋巴結轉移的關系

從表2 中可以看出，有頸部淋巴結轉移的鼻咽癌組織中P16 表達陽性率為27.8%（5/18），無頸部淋巴結轉移鼻咽癌組織中P16 表達陽性率為36.4%（8/22），經統計學分析，二者差異無統計學意義（χ2=3.402，P ＞ 0.05）。

表2 鼻咽鱗狀細胞癌組織中P16蛋白表達與頸部淋巴結轉移的關系（例）

2.3 鼻咽鱗狀細胞癌組織中P16 表達與鼻咽癌臨床分期的關系

按照慣例，將臨床鼻咽癌Ⅰ期和 Ⅱa期、Ⅱb期劃分為癌癥早期，將Ⅲ期和Ⅳ期劃分為癌癥晚期。由表3 可見，早期與晚期比較，P16 蛋白表達差異無統計學意義（χ2=1.432，P＞0.05）。

表3 鼻咽鱗狀細胞癌組織中P16表達與鼻咽癌臨床分期的關系（例）

2.4 鼻咽鱗狀細胞癌組織中Bcl-2 蛋白表達與組織分化程度的關系

從表4 中可以看出，40例鼻咽癌組織中bcl-2 的表達隨分化程度的升高而降低，不同分化程度間差異有統計學意義（χ2=9.512，P＜0.05）。Bcl-2 在鼻咽鱗狀細胞癌組織中的陽性表達情況，見圖2。

表4 鼻咽鱗狀細胞癌組織中Bcl-2表達與組織分化程度的關系（例）

圖2 bcl-2 陽性表達的免疫組化圖（×400）

2.5 鼻咽鱗狀細胞癌組織中Bcl-2 蛋白表達與鼻咽癌臨床分期的關系

按照慣例，將鼻咽癌臨床Ⅰ期和 Ⅱa期、Ⅱb期劃分為癌癥早期，將Ⅲ期和Ⅳ期劃分為癌癥晚期。由表5 可見，早期與晚期比較，Bcl-2 表達差異有統計學意義 （χ2=6.488，P＜0.05）。

表5 鼻咽鱗狀細胞癌組織中bcl-2表達與鼻咽癌臨床分期的關系（例）

2.6 鼻咽鱗狀細胞癌組織中bcl-2 蛋白表達與頸部淋巴結轉移的關系

從本研究表6 可以看出，在18例有頸部淋巴結轉移的患者中，Bcl-2 表達陽性的有16例，占88.9%，在22例頸部淋巴結轉移陰性的患者中，有18例Bcl-2 表達為陽性，占81.8%，經統計學分析，Bcl-2 的表達與淋巴結的轉移無明顯相關性，差異無統計學意義（χ2=2.306，P ＞ 0.05）。

表6 鼻咽鱗狀細胞癌組織中Bcl-2表達與頸部淋巴結轉移的關系（例）

2.7 P16 和Bcl-2 蛋白在鼻咽部慢性炎癥組織中的表達

本研究中表7 可以看出，P16 和Bcl-2 蛋白在鼻咽部慢性炎癥組織中表達差異有統計學意義 （χ2=10.490，P＜0.001）。P16 在鼻咽部慢性炎癥組織中明顯呈高表達，陽性率為68.7%，而Bcl-2 在鼻咽部慢性炎癥組織中明顯呈低表達，陽性率為12.5%。

表7 P16和Bcl-2在鼻咽部慢性炎癥組織中的表達（例）

2.8 鼻咽癌組織P16 和Bcl-2 蛋白表達的相關性

在鼻咽部鱗狀細胞癌組織中，P16 的表達和Bcl-2 的表達呈負相關關系（P ＜ 0.05，r=-0.844 8）。 見表8。

表8 鼻咽癌組織P16和Bcl-2蛋白的表達的相關性（例）

3 討論

近年來，人們對鼻咽癌的研究越來越深入，其中，對癌基因和抑癌基因的研究也逐漸成為熱點[4]?，F在越來越多的證據表明，P16 和Bcl-2 蛋白在鼻咽癌的發生、發展中起重要作用。在細胞增殖的調控中，P16 蛋白發揮負性調節的作用，P16 的失活會導致CDK4 的活性增強，從而導致細胞非正常增殖致使腫瘤形成。但P16 基因直接誘導細胞凋亡的報道較少，而從已知的P16 基因作用機制和凋亡調節機制分析，P16可能并不直接參與凋亡的發生，而是通過調控細胞周期與誘導凋亡因子共同作用誘導凋亡發生。本研究中，P16 蛋白在慢性炎癥組織中的表達率為68.7%，在鼻咽鱗狀細胞癌組織中的表達率為32.5%，兩者差異有統計學意義 （P＜0.05）；P16 在頸部淋巴結轉移陽性的鼻咽組織中表達率為27.8%，在頸部淋巴結轉移陰性組織中的表達率為36.4%，二者有一定差異，但無統計學意義（P＞0.05）。這說明在鼻咽癌中P16確實有促進細胞凋亡的作用，因此，P16 蛋白表達低下或缺失，一方面導致細胞惡性增殖，另一方面導致細胞凋亡機制缺陷，這可能與鼻咽癌的發生、發展有一定關系。

Bcl-2 是迄今為止研究最深入的凋亡基因之一，其表達的改變不僅影響DNA損傷細胞或周期異常細胞的正常凋亡，還影響腫瘤細胞自身的凋亡。目前Bcl-2 抑制細胞凋亡的機制尚未明確。文獻報道Bcl-2 蛋白在鼻咽癌組織中的表達情況為61%～86%[5-6]。正常鼻咽黏膜由基底細胞發生，向表層細胞移行，分化成熟，有旺盛增殖能力的基底層細胞有Bcl-2 的低表達，而基底層以上細胞無Bcl-2 表達。本研究用免疫組化的方法檢測Bcl-2 蛋白在鼻咽癌組織和鼻咽黏膜慢性炎癥組織中的表達率分別是 85.0%（34/40）、12.5%（2/16），結果與文獻一致[5-6]。由于在鼻咽癌中Bcl-2 的表達增強與P16 的失活同時存在，推測P16 失活后失去對Bcl-2 表達的抑制可能是Bcl-2 表達增加的原因。Bcl-2 基因通過抑制細胞凋亡，延長細胞壽命，增加細胞其他基因突變機會或使突變基因在細胞內積聚導致細胞惡性轉化，從而導致細胞腫瘤的發生發展。從本研究結果可見，Bcl-2 在鼻咽部慢性炎癥組織中明顯呈低表達，陽性率為12.5%，而在鼻咽癌組織中的表達率為85.0%（34/40），呈高表達；Bcl-2 蛋白的陽性表達率在有無淋巴結轉移的鼻咽癌組織中比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；在不同臨床分期中，鼻咽癌早期和晚期的Bcl-2 蛋白表達差異有統計學意義（P＞0.05），從一定程度上說明了Bcl-2 在鼻咽鱗狀細胞癌的異常表達是鼻咽癌比較早期的事件，表達程度與鼻咽癌的臨床分期有關系，和鼻咽癌的頸部淋巴結轉移關系不密切。

綜上所述，P16 在鼻咽部慢性炎癥組織中高表達，在鼻咽鱗狀細胞癌組織中低表達。因此，P16 檢測可以為鼻咽癌早期診斷提供依據，伴有P16 缺失可能是早期鼻咽癌的一個特點。Bcl-2 在分化程度低的癌組織中高表達，在分化程度高的癌組織中低表達；在晚期鼻咽鱗狀細胞癌中高表達，在早期鼻咽鱗狀癌中低表達。因此，Bcl-2 蛋白檢測可以作為判斷鼻咽癌病情和預后的指標，也可以通過動態檢測Bcl-2 來監測病情變化。在鼻咽鱗狀細胞癌中，Bcl-2 高表達，P16 低表達，二者呈負相關關系。由此可見，通過基因治療，降低Bcl-2的表達，提高P16 的表達是治療鼻咽癌的方向。聯合檢測二者，可以作為評價治療是否有效的指標。

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