湖南、江西產侗藥血馬鞭的總三萜含量測定△

鄭欽方 汪 冶

(1.湖南農業大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128;2.懷化醫學高等專科學校中醫藥現代化研究中心，湖南 懷化 418000)

血馬鞭是一種侗族藥物，其植物來源為馬鞭草科(Verbenaceae)紫珠屬(Callicarpa L.)植物廣東紫珠(Callicarpa kwangtungensis Chun)的干燥全株，中國藥典2010年版收載的廣東紫珠，其入藥部位是干燥地上部分［1］。血馬鞭具有收斂止血，散瘀，清熱解毒的功效。主要用于治療咯血，便血，崩漏，肺熱咳嗽，咽喉腫痛，熱毒瘡瘍，水火燙傷［1］。

血馬鞭的主要化學成分為黃酮類、三萜類、苯丙素糖苷類等［2］。近年來，研究較多的為黃酮類成分，對三萜類成分研究較少。血馬鞭中三萜主要為齊墩果酸、熊果酸、白樺酸［3，4］，其中熊果酸和齊墩果酸具有抗炎、保肝、抗腫瘤、抗HIV、抗菌、抗潰瘍、降血糖和降血脂等功效［5］。全國有18家制藥企業生產抗宮炎片或抗宮炎膠囊，因血馬鞭藥材需求量大，現湖南懷化、江西萍鄉等地已開展大規模栽培，為更好的開發血馬鞭資源，特對血馬鞭中的總三萜含量測定進行研究，以對血馬鞭的質量進行評價，為開發利用提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器:UV－4802型紫外可見分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)，KQ－250DB型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)，PS－80AL超聲儀(深圳市科潔超聲科技公司)HZK－FA－210電子天平(美國華志)。

1.2 藥材:血馬鞭樣品分別為湖南懷化會同縣連山基地栽培藥材，湖南懷化雪峰山野生藥材，懷化郊區林下自然生長藥材，江西萍鄉的大田栽培1年生和多年生藥材，經懷化醫學高等專科學校汪冶教授鑒定，均為馬鞭草科紫珠屬植物廣東紫珠。采收的廣東紫珠藥材均使用陰干法干燥。

1.3 試劑與試藥:齊墩果酸對照品購于中國藥品生物制品檢定所(批號:110709－200505)，無水乙醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 血馬鞭總三萜成分含量測定方法的建立

2.1.1 顯色方法及測定波長的選擇:分別精密吸取齊墩果酸對照品溶液和供試品溶液適量至具塞試管中，水浴揮干溶劑，各加入新配置的5%香草醛－冰醋酸0.3mL，高氯酸1.0mL，密塞搖勻，于60℃水浴中加熱 10min，取出立即置冰浴中冷卻，加入冰醋酸5mL，搖勻。以空白試劑為對照，于200～800nm波長范圍內進行掃描，結果對照品溶液和供試品溶液在546nm處有最大吸收，故選取546nm為測定波長。

2.1.2 標準曲線的繪制:精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸標準品4.2mg置于50 mL的量瓶中，加入無水乙醇超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻，即質量濃度為0.084 mg·ml－1的標準品溶液。分別精確吸取標準品溶液 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 于具塞試管中，水浴揮盡溶劑，按“2.1.1”項下方法，在546nm波長下測定吸光度。以齊墩果酸質量濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為:y=0.1894x+0.0029，R2=0.9992。結果表明齊墩果酸在0.0084 ～0.084mg·ml－1濃度范圍內，濃度與吸光度呈現良好的線性關系。

2.2 血馬鞭總三萜提取方法的考察

表1 正交實驗設計

2.2.1 正交實驗設計:經過單因素考察，選擇乙醇濃度(A)、超聲溫度(B)、提取時間(C)、超聲功率(D)，4因素作為考察對象，每個因素3個水平，以提取物中總三萜類含量為評價指標，用L9(34)正交試驗表進行正交試驗，其因素水平選取見表l，實驗結果見表2。

表2 超聲提取正交實驗結果

2.2.2 正交實驗考察結果:對血馬鞭總三萜超聲提取結果的數據進行直觀分析，可以看出，影響因素順序為C＞D＞A＞B，即超聲提取時間對總三萜得率影響最大，提取溫度對總三萜得率影響最小。根據分析結果得到最佳提取工A2B2C3D1，即乙醇濃度85%，提取溫度為40℃，提取時間30min，超聲功率250W。

2.3 供試品溶液制備方法:精密稱取各血馬鞭樣品約2g，加10倍85%乙醇，40℃，250W超聲提取30min，過濾，提取3次，合并3次提取液，置于旋轉蒸發儀中蒸干，殘渣加無水乙醇15ml，超聲溶解，加活性炭適量，70℃水浴15min脫色，趁熱過濾，加無水乙醇定容至25mL，作為供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度實驗:精密吸取齊墩果酸對照品溶液適量于具塞試管中，平行測定5份，按“2.1.1”項下方法顯色，測定吸光度，計算含量。結果RSD=0.50%(n=5)。

2.4.2 穩定性考察:精密吸取齊墩果酸對照品溶液適量于具塞試管中。按“2.1.1”項下方法顯色，放置 l0，20，30，40，50，60 min后，分別測定吸光度，計算含量。結果在對照品在60min 內穩定，RSD=1.55%(n=6)。

2.4.3 重現性考察:精確稱取同一批血馬鞭樣品5份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下方法顯色，分別測定吸收度，計算含量。結果RSD=0.87%(n=5)。

2.4.4 回收率試驗:精確稱取已知含量的血馬鞭樣品，準確加入齊墩果酸對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下方法顯色，平行測定5份。結果平均加樣回收率為:98.5%，RSD=1.45%(n=5)。

2.5 不同產地血馬鞭總三萜含量測定:精密吸取各供試品溶液50μL于具塞試管中，按“2.1.1”項下方法顯色，根據標準曲線分別計算總三萜的含量。結果見表3。

表3 湖南、江西產血馬鞭總三萜含量

3 小結與討論

3.1 本研究采用正交實驗，得到了血馬鞭總三萜的最佳提取方法，該提取方法簡便易行，對血馬鞭研究具有指導意義。

3.2 含量測定結果表明，湖南、江西產血馬鞭總三萜含量有差異，其中湖南懷化會同縣栽培的血馬鞭總三萜含量最高，懷化郊區林下自然生長的血馬鞭總三萜含量最低。江西萍鄉栽培的1年生及多年生血馬鞭總三萜含量相近，沒有顯著差異。

3.3 本實驗所選樣品，為10月份采收，10月份以前及11月份以后的總三萜含量有待進一步研究。

3.4 湖南懷化雪峰山野生血馬鞭與湖南懷化郊區林下自然生長的血馬鞭光照不足，水分相對充足，總三萜含量較低，這可能是總三萜的富集與光照、水分脅迫有關。湖南懷化會同栽培的血馬鞭生長在山上，光照非常充足，且比較干旱，總三萜含量較高。說明總三萜含量與光照條件、干旱脅迫有關。提示血馬鞭的栽培不應在林下進行，不能作為林下藥材栽培或與其他作物套種。至于水分脅迫、干旱脅迫與光照作用對總三萜的富集影響情況有待下文研究。

［1］國家藥典委員會.中國藥典2010年版.一部［S］.2000:40.

［2］聶韡，朱培林，黃麗莉，等.廣東紫珠藥材的研究進展［J］.中國現代中藥，2011，13(9):37.

［3］周伯庭，李新中，徐平聲，等.廣東紫珠地上部位化學成分研究(I)［J］.中南藥學，2004，2(4):238-239.

［4］陳艷華，馮鋒，任冬春，等.廣東紫珠地上部分的化學成分［J］.中國天然藥物，2008，6(2):120-122.

［5］盛艷樂，趙大球，周春華，等.植物熊果酸和齊墩果酸分析的研究進展［J］.中國農學通報:2009，25(23):347.