JAB1對缺氧環境肺癌A549細胞化療敏感性調控的研究＊

胡明冬，徐劍鋮△，楊 昱，徐 靜，周長喜，毛 梅，王 藝

（1.第三軍醫大學新橋醫院全軍呼吸內科研究所，重慶400037；2.解放軍總醫院南樓呼吸內科，北京100039；3.廣州軍區武漢總醫院呼吸內科，武漢430061）

JAB1對缺氧環境肺癌A549細胞化療敏感性調控的研究＊

胡明冬1，徐劍鋮1△，楊 昱1，徐 靜1，周長喜2，毛 梅3，王 藝1

（1.第三軍醫大學新橋醫院全軍呼吸內科研究所，重慶400037；2.解放軍總醫院南樓呼吸內科，北京100039；3.廣州軍區武漢總醫院呼吸內科，武漢430061）

目的 觀察導入pcDNA3.1－HRE－JAB1真核表達質粒的肺癌A549細胞，在低氧環境下對健擇（Gemzar）的化療敏感性，以期找到一種提高肺癌化療敏感性的方法。方法 首先構建缺氧反應元件啟動的pcDNA3.1－HRE－JAB1真核表達質粒，鑒定后將該質粒導入肺癌A549細胞。在低氧環境培養過程中加入化療藥物Gemzar，觀察空白組（A549）、空載體組（A549＋pcDNA3.1－HRE）和質粒組（A549＋pcDNA3.1－HRE－JAB1）肺癌A549細胞對Gemzar的敏感性。采用Real－time PCR和Western blot分別檢測各組肺癌A549細胞中JAB1的mRNA和蛋白表達水平；流式細胞術檢測各組肺癌A549細胞周期分布和凋亡情況。結果 通過雙酶切鑒定，確定構建獲得了pcDNA3.1－HRE－JAB1質粒。在有化療藥物Gemzar的情況下，質粒組分別與空白組或空載體組比較，質粒組肺癌A549細胞中JAB1mRNA和蛋白表達水平明顯增加（P＜0.01），細胞凋亡率明顯增加（P＜0.01），而細胞周期被明顯阻滯于G1期（P＜0.01）。結論 JAB1在低氧環境下高表達提高了藥物Gemzar化療的敏感性，這將可能成為一種理想的提高肺癌或其他實體惡性腫瘤化療敏感性的手段。

A549細胞；JAB1；耐藥；健擇；化療敏感性

在腫瘤中肺癌的發病率最高，盡管采用了許多方法進行治療，患者的5年生存率仍只有14%左右［1］。通常情況下，肺癌細胞受到化療藥物作用后，絕大部分細胞死亡或凋亡，而小部分細胞由于缺氧，無法啟動細胞內部正常的凋亡程序，僅出現亞致死損傷或潛在致死性損傷，最終導致化療不徹底并出現對化療藥物的抗性［2］，所以，采用各種方法促使這部分缺氧肺癌細胞的死亡是克服化療耐藥甚至徹底治愈腫瘤的重要策略。近年來，隨著對腫瘤乏氧區細胞特性的深入研究，為改善乏氧細胞的耐藥提供了可能的途徑。在諸多方法中，促凋亡基因的應用對促進腫瘤細胞的凋亡是一個極有前景的方法［3］。因此，本實驗擬在低氧環境下培養肺癌A549細胞（模擬乏氧區癌細胞），導入含JAB1凋亡基因的質粒，觀察在化療藥物作用下化療敏感性的變化，以找到更好的治療肺癌甚至其他腫瘤的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株 肺腺癌細胞株A549，由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 Taq酶、DNaseI（RNase free，TaKaRa公司）；PCR引物（上海英駿生物技術公司合成）；胎牛血清、胰蛋白酶、RNA提取試劑Tripure reagent（Roche公司，美國）；MMLV Reverse Transcriptase（Promega公司）；Gemzar（F.H.Faulding公司，澳大利亞）；陽離子脂質體LipofectamineTM2000（上海英駿生物技術公司）。

1.1.3 主要儀器 Bio－Rad核酸蛋白測定儀；192型Sub－Cell電泳槽和全自動凝膠成像系統（Bio－Rad公司，美國）；2720型PCR儀（ABI公司，美國）；FACScan型流式細胞儀（Becton Dickinson公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 構建人pcDNA3.1－HRE－JAB1真核表達質粒 從基因庫獲得人JAB1基因序列，利用生物軟件Premier5.0設計引物，通過RT－PCR獲得人完整JAB1基因片斷，利用酶切方法合成真核表達質粒pcDNA3.1－JAB1，并經過測序鑒定，人工合成缺氧反應元件啟動子（HIF－1/HRE）串聯重復序列，利用酶切方法將串聯重復系列插入到pcDNA3.0質粒CMV啟動子上端，獲得重組質粒pcDNA3.1－HRE－JAB1，通過雙酶切法進行鑒定。

1.2.2 pcDNA3.1－HRE－JAB1質粒轉染、A549細胞的厭氧培養［4］及其JAB1基因mRNA表達水平的檢測 細胞轉染采用陽離子脂質體LipofectamineTM2000。在轉染前1d，將A549細胞置于6孔培養板中，當細胞鋪滿培養板的面積達70%～80%時，即可進行轉染。具體操作過程：首先，將A549細胞在含有質粒pcDNA3.1－HRE－JAB1（1ng）培養基中培養10h（質粒組）；然后，將培養基更換為普通培養基培養48h。加入400 μg/mL遺傳霉素G418（Roche公司，美國）培養14d篩選陽性細胞。相應地，對照組細胞轉染pcDNA3.1－HRE空載體（空載體組）。在一個缺氧手套盒（Coylab，Grass Lake，美國）中，將A549細胞暴露于缺氧環境（0.3%O2）24h。同時，采用15 μg/mL健擇（Gemzar）處理轉染的細胞。另外，缺氧暴露后如需要更換培養液，需在用前將其在缺氧環境中平衡24h。低氧環境下培養后A549細胞中JAB1基因mRNA表達水平的變化通過2－△△CT方法［5］進行計算。

1.2.3 低氧培養后A549細胞JAB1蛋白表達水平的檢測

收集A549細胞，立即加入150μL預冷去污劑裂解液，隨后劇烈振蕩15s，冰浴10min。隨后以超聲破碎細胞，100W，3次，每次約5s。接著12 000×g、4℃離心10min。按PIERCE蛋白測定試劑盒說明進行蛋白質定量檢測，樣本分裝于－80℃冰箱中保存備用。將提取液的蛋白濃度調整一致，各取30μg蛋白經12%十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，干法轉膜至PVDF膜上，參數為15V，20min。

轉膜結束后用含5%脫脂奶粉封閉4h，TBS洗膜3次，每次5min。隨后分別加入鼠抗JAB1，Caspase－3單克隆抗體（BD Biosciences，美國）（1∶500），4℃過夜孵育。隨后加入辣根過氧化物（HRP）標記兔抗鼠IgG（中山金橋生物科技有限公司，北京）（1∶3 000），4℃孵育2h。TBS洗膜2次，每次5 min。采用ECL著色，溫育2min。進入暗室，將X光膠片壓在PVDF膜上，依照發光的強度選擇不同的曝光時間。將膠片放入顯影液中，出現條帶后，立即放入定影液中，流水沖洗膠片后晾干。對膠片進行掃描，然后用Bio－Rad成像系統分析目的條帶的灰度值。結果判斷，以JAB1的灰度值與β－actin的灰度值的比值表示JAB1蛋白相對表達水平。

1.2.4 A549細胞周期及凋亡檢測 將1.0×104對數生長期細胞接種于96孔培養板中（100μL/well），按以下分組：A549＋Gemzar（空白組），A549＋pcDNA3.1－HRE＋Gemzar（空載體組），A549＋pcDNA3.1－HRE－JAB1＋Gemzar（質粒組），每孔中加入濃度為15μg/mL的Gemzar進行試驗觀察。

各組厭氧培養48h后去上清液，收集細胞，PBS洗滌3次。采用70%乙醇固定，Annexin－V、PI雙著色，用FACScan流式細胞儀進行檢測。

2 結 果

2.1 pUC57－HRE－JAB1質粒的構建，雙酶切鑒定 見圖1。

圖1 pUC57－HRE－JAB1質粒的鑒定

2.2 pcDNA3.1－HRE－JAB1質粒導入對A549細胞中JAB1 mRNA表達水平的影響 pcDNA3.1－HRE－JAB1質粒導入后，與空白組或空載體組比較，質粒組JAB1mRNA表達水平明顯升高（P＜0.01），見表1。

表1 pcDNA3.1－HRE－JAB1導入對A549細胞中JAB1mRNA水平的影響±s，n＝8）

表1 pcDNA3.1－HRE－JAB1導入對A549細胞中JAB1mRNA水平的影響±s，n＝8）

＊：P＜0.01與空白組比較；＃：P＜0.01，與空載體組比較。

組別Fold change2－△△CT空白組1.3±0.3空載體組1.5±0.2質粒組2.9±0.4＊＃

2.3 pcDNA3.1－HRE－JAB1質粒導入對A549細胞中JAB1蛋白水平的影響 pcDNA3.1－HRE－JAB1質粒導入后，與空白組或空載體組比較，質粒組JAB1蛋白水平明顯升高（P＜0.01），見表2、圖2。

圖2 各組JAB1蛋白的表達

2.4 pcDNA3.1－HRE－JAB1導入對A549細胞周期與凋亡的影響 流式細胞儀檢測結果提示在Gemzar存在的情況下，經pcDNA3.1－HRE－JAB1轉染后，質粒組與空白組和空載體組比較，G0/G1期細胞數量明顯增多（P＜0.01），而G2/M期細胞數量明顯減少（P＜0.01），增殖指數（PI）明顯降低（P＜0.01），見表3、圖3。

表2 pcDNA3.1－HRE－JAB1導入對A549細胞中JAB1蛋白水平的影響±s，n＝8）

表2 pcDNA3.1－HRE－JAB1導入對A549細胞中JAB1蛋白水平的影響±s，n＝8）

＊：P＜0.01，與空白組比較；＃：P＜0.01與空載體組比較。

組別JAB1蛋白水平空白組0.6±0.1空載體組0.7±0.2質粒組2.3±0.4＊＃

表3 pcDNA3.1－HRE－JAB1質粒導入對A549細胞周期分布的影響±s，%，n＝8）

表3 pcDNA3.1－HRE－JAB1質粒導入對A549細胞周期分布的影響±s，%，n＝8）

＊：P＜0.01與空白組比較；＃：P＜0.01與空載體組比較。PI＝（S＋G2M）/（G0/G1＋S＋G2M）。

組別G0/G1期S期G2/M期PI期空白組62.3±5.3 35.9±3.4 2.8±0.6 38.7±4.2空載體組62.1±5.5 35.7±3.6 3.2±0.7 38.9±4.8質粒組72.9±5.6＊＃26.0±2.5＊＃1.1±0.4＊＃27.1±2.4＊＃

圖3 pcDNA3.1－HRE－JAB1導入對A549細胞周期與凋亡的影響

3 討 論

化療是肺癌治療最常采用的一種方法。通常情況下，化療藥物將使大多數腫瘤細胞發生致死性殺傷或凋亡，然而少數仍會存活，研究發現它們主要位于腫瘤缺氧區［6］。因缺氧導致化療藥物細胞毒所需的氧供不足而導致腫瘤細胞耐藥；同時，由于腫瘤細胞增殖活躍，氧供與氧耗的失衡也將導致耐藥發生［7］。有研究者通過轉染化療敏感基因，使其表達增強來降低化療耐藥，實驗過程中發現在陽離子脂質體介導的p16INK4a和p14ARF基因轉染導入A549細胞后，細胞凋亡和化療的敏感性有所增加，但未取得預想的效果［8］。其原因可能是由于它們低的轉染效率及靶向特異性差，且它們在細胞周期調控路徑中具有雙重作用，既誘導細胞凋亡，也可阻滯細胞周期，因此，雖然它們在一定程度上發揮了作用，但難以取得令人滿意的效果。

而近年來發現的抑癌基因JAB1，是目前所發現的惟一專職促進癌細胞凋亡的基因［9］。一系列的研究發現，將JAB1基因導入乳腺癌細胞中可明顯降低p27kip1的表達水平；同樣鼻咽癌組織中p27kip1表達與其增殖活性與侵襲能力密切相關［10］；Liu等［11］發現JAB1與BclGs（Bcl－Gonad short form）的共表達可協同誘導HeLa細胞的凋亡，JAB1能夠與Bcl－XL/Bcl－2競爭結合到BclGs上，從而促進細胞凋亡。相反，當通過RNAi技術沉默JAB1基因時，BclGs的前凋亡效應明顯減弱。因此，以上實驗均表明，當機體組織中JAB1高表達時，癌細胞往往能發生有效的凋亡。

研究發現機體肺癌乏氧區JAB1基因表達往往很低，因此，必須找到JAB1在低氧條件下高表達的方法。本實驗設想如果能構建出在厭氧環境下能高表達JAB1的質粒，將其導入肺癌乏氧區細胞，那么，它們對化療藥物敏感性就可能提高。有研究表明，缺氧誘導因子－1（HIF－1）是哺乳動物中的一種轉錄因子，于1993年在缺氧誘導的細胞中被確認［12］。在缺氧條件下，HIF－1的表達受缺氧反應元件啟動子（HIF－1/HRE）的調控［13］，而HIF－1/HRE可明顯促進目的基因在缺氧環境中表達［5］。因此，本研究首先擴增人類JAB1全長片段，隨后將其插入pcDNA3.1載體構建pcDNA3.1－HRE－JAB1真核表達質粒，并將該質粒導入在低氧環境培養下的A549細胞中，通過qRT－PCR與Western blot檢測質粒轉染后的細胞表達JAB1基因情況，與空白組或空載體組比較，質粒組JAB1的mRNA和蛋白水平均明顯升高，表明pcDNA3.1－HRE－JAB1質粒可在缺氧環境中高表達JAB1。

本實驗證實高表達的JAB1基因能在厭氧環境下提高A549細胞的化療敏感性。導入pcDNA3.1－HRE－JAB1質粒轉染的A549細胞在厭氧環境培養下，使用化療藥物Gemzar后，發現較空白組和空載體組G0/G1期細胞數量明顯增多，而G2/M期細胞數量明顯減少，增殖指數（PI）明顯降低，也就是A549細胞周期明顯阻滯于G1期以前，細胞的分裂減少，A549細胞凋亡增多。與Tomoda等［14］研究結果在某種程度上基本一致，他發現JAB1－/－小鼠的胚胎細胞增殖緩慢，且細胞周期延遲于G0和S期之間。因此，JAB1具有通過調節細胞周期信號通路發揮控制細胞周期進程和促進細胞凋亡的作用。

綜上所述，本實驗發現在A549細胞中導入含JAB1凋亡基因的質粒能在低氧環境下高表達JAB1，且比單獨使用化療藥A549細胞凋亡明顯增多，實現了低氧環境下JAB1基因增強A549細胞對化療藥物的敏感性，因此，可能找到了一種克服肺癌化療耐藥的方法。

［1］Toh CK.The changing epidemiology of lung cancer［J］.Methods Mol Biol，2009，472（5）：397－411.

［2］Harrison L，Blackwell K.Hypoxia and anemia：factors in decreased sensitivity to radiation therapy and chemotherapy？［J］.Oncologist，2004，56（1）：31－40.

［3］Yang QC，Zeng BF，Shi ZM，et al.Inhibition of hypoxiainduced angiogenesis by trichostatin A via suppression of HIF－1aactivity in human osteosarcoma［J］.J Exp Clin Cancer Res，2006，25（10）：593－599.

［4］Maher JC，Wangpaichitr M，Savaraj N，et al.Hypoxia－inducible factor－1confers resistance to the glycolytic inhibitor 2－deoxy－D－glucose［J］.Mol Cancer Ther，2007，6（12）：732－741.

［5］Semenza GL.HIF－1：mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia［J］.J Appl Physiol，2000，88（10）：1474－1480.

［6］Bell EN，Tse MY，Frederiksen LJ，et al.Atrial natriuretic peptide attenuates hypoxia induced chemoresistance in prostate cancer cells［J］.J Urol，2007，177（2）：751－756.

［7］Yasuda H.Solid tumor physiology and hypoxia－induced chemo/radio－resistance：novel strategy for cancer therapy：nitric oxide donor as a therapeutic enhancer［J］.Nitric Oxide，2008，19（6）：205－216.

［8］Xie QC，Hu YD，Wang LL，et al.The co－transfection of p16（INK4a）and p14（ARF）genes intohuman lung cancer cell line A549and the effects on cell growth and chemosensitivity［J］.Colloids Surf B Biointerfaces，2005，46（3）：188－196.

［9］Park CM，Park MJ，Kwak HJ，et al.Induction of p53－mediated apoptosis and recovery of chemosensitivity through p53transduction in human glioblastoma cells by cisplatin［J］.Int J Oncol，2006，28（1）：119－125.

［10］Kouvaraki MA，Rassidakis GZ，Tian L，et al.Jun activation domain－binding protein 1expression in breast cancer inversely correlates with the cell cycle inhibitor p27Kip1［J］.Cancer Res，2003，63（11）：2977－2981.

［11］Liu X，Pan Z，Zhang L，et al.JAB1accelerates mitochondrial apoptosis by interaction with proapoptotic BclGs［J］.Cell Signal，2008，20（3）：230－240.

［12］Wang GL，Semenza GL.General involvement of hypoxiainducible factor 1in transcriptional response to hypoxia［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90（11）：4304－4308.

［13］Post DE，Van Meir EG.Generation of bidirectional hypoxia/HIF2responsive expression vectors to target gene expression to hypoxia cells［J］.Gene Ther，2001，56（8）：1801－1807.

［14］Tomoda K，Yoneda－Kato N，Fukumoto A，et al.Multiple functions of JAB1are required for early embryonic development and growth potential in mice［J］.J Biol Chem，2004，279（8）：43013－43018.

Investigation on human lung cancer cell A549 chemotherapeutic sensitivity regulated by JAB1 in anaerobic condition＊

Hu Mingdong1，Xu Jiancheng1△，Yang Yu1，Xu Jing1，Zhou Changxi2，Mao Mei3，Wang Yi1
（1.Institute of Respiratory Diseases of PLA，Xinqiao Hospital，Third Military Medical University，Chongqing400037，China；2.Department of Respiratory Diseases，General Hospital of PLA，Beijing100039，China；3.Department of Respiratory Diseases，Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command，Wuhan 430061，China）

ObjectiveTo find the way of improving the lung cancer chemotherapeutic sensitivity，we investigated whether the lung cancer A549cells introduced eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1－HRE－JAB1plasmid have the chemotherapeutic sensibility to Gemzar in anaerobic condition.MethodsWe first constructed an eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1－HRE－JAB1 driven by hypoxia response elements promoter.Then，the plasmid was introduced into lung cancer cell line A549.After that，chemotherapeutic drug such as Gemzar was used to treat the A549cells in anaerobic condition，and investigated that the normal control（A549），the empty vector group（A549＋pcDNA3.1－HRE）and the plasmid group（A549＋pcDNA3.1－HRE－JAB1）A549cells had chemotherapeutic sensitivity.qRT－PCR and Western blot was used to assay the mRNA and protein level of JAB1.Cell cycle and apoptosis of A549cells were also assayed according to flow cytometry.ResultsAccording to bi－enzyme digestion evaluation，obtained plasmid was pcDNA3.1－HRE－JAB1plasmid.The results showed that JAB1in the A549was overexpressed after the transfection of pcDNA3.1－HRE－JAB1compared with the normal control and the empty vector（P＜0.01）.The cell proliferation was arrested at G1phase and the cell apoptosis was significantly enhanced after the transfection（P＜0.01）.ConclusionJAB1overexpression significantly increase sensitivity of lung cancer cells to the chemotherapeutic drug Gemzar in anaerobic condition，which might provide an efficient strategy of improving the chemotherapeutic sensitivity of lung cancer or the other cancers.

A549cell；JAB1；drug resistance；Gemzar；chemotherapeutic sensitivity

book=2345,ebook=24

10.3969/j.issn.1671－8348.2012.23.001

A

1671－8348（2012）23－2345－03

國家自然科學基金資助項目（30801366）。△

，Tel：（023）68755003；E－mail：xu822036＠sohu.com。

2011－10－09

2012－01－06）

△通訊作者，Tel：15825902443；E－mail：yaoyeye1987＠163.com。