雌激素改善大鼠記憶及促進海馬BDNF蛋白表達上調

唐明山

（重慶市巴南區人民醫院神經內科 401320）

雌激素改善大鼠記憶及促進海馬BDNF蛋白表達上調

唐明山

（重慶市巴南區人民醫院神經內科 401320）

目的探討雌激素改善大鼠記憶與BDNF表達的關系。方法停止繁殖的15月齡雌性大鼠，體質量350～400g，隨機分為治療組和對照組，在頸部皮下分別注射相同劑量的苯甲酸雌二醇和生理鹽水。采用Morris水迷宮檢測大鼠記憶，大鼠海馬BDNF、TrkB及mRNA表達采用RT－PCR檢測，BDNF、TrkB及proBDNF蛋白表達采用Western－blot檢測。結果治療組大鼠潛伏期縮短，海馬BDNF、TrkB、proBDNF表達上調（P＜0.01）。結論雌激素改善大鼠記憶，可能與BDNF及相關蛋白表達上調有關。

雌激素；記憶；腦源性神經營養因子

研究表明，腦源性神經生長因子（brain－derived nerve growth factor，BDNF）與學習記憶有關［1－2］，BDNF是在腦內合成的一種蛋白質，它廣泛分布于中樞神經系統內。有關運用雌激素改善記憶的研究頗多，盡管結論不一，多數研究認為，絕經后婦女血漿雌激素水平降低可能使認知功能惡化［3］，至少在絕經后特定的時間窗內，雌激素替代治療能改善認知功能［3－4］。有關雌激素改善認知功能的機理尚不清楚，結合BDNF與記憶的關系，本研究觀察雌激素治療后大鼠海馬BDNF、高親和受體酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）和BDNF前體蛋白（precursor protein of brain－derived neurotrophic facton，proBDNF）表達的變化，了解其與大鼠記憶改變的關系，探討雌激素替代治療影響絕經后大鼠認知功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 93只清潔級Sprague－Dawley雌性大鼠，15月齡左右，已自然停止繁殖2個周期，體質量350～400 g，由第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所實驗動物中心提供。隨機分為治療組和對照組，每組各35只，備用8只（每組4只），7只在手術中或術后死亡。每組在7d和30d兩個時相點進行觀測。

1.2 模型制備 先將所有大鼠在實驗前放入不放置水下平臺的水迷宮中游泳4次（上下午各2次），剔除原地打轉的大鼠8只后，隨機分為雌激素替代治療組及對照組。模型制備按有關文獻［5］，雌激素替代治療組切除雙側卵巢，對照組按相同方法打開腹腔，找到卵巢后不切除卵巢，關腹。所有手術操作均由同一實驗人員完成，避免不同人員操作引起的誤差。兩組大鼠于相應時相點取材或行有關實驗。

1.3 動物飼養 手術完畢后的實驗動物在第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所實驗動物中心按組分籠喂養，每組每籠對編號、組別、數量、手術時間進行標識，5只大鼠為一籠進行喂養，飼料由動物實驗中心提供普通大顆粒飼料，按每200g標準體質量大鼠每天進食15g干飼料匡算，限量分籠投食，自由飲水，每天07：00～19：00保證光照12h，定時通風，每日早、晚沖洗大鼠排泄物，空調調節室溫，使室溫保持在17℃～23℃。

1.4 給藥方法 實驗動物術后恢復1個月，從第17月齡開始，每日治療組大鼠頸部皮下注射苯甲酸雌二醇（estradiol benzoate，EB）25mg·kg－1·d－1［6］，對照組大鼠頸部皮下注射相同劑量生理鹽水。為保持大鼠血漿雌二醇濃度，避免雌二醇波動引起的認知功能檢查的誤差，水迷宮實驗階段每日仍按上述方法進行苯甲酸雌二醇或生理鹽水注射。

1.5 記憶功能檢測 采用中科院研制生產的Morris水迷宮（morris water maze，MWM）3.0對大鼠記憶功能檢測。實驗前1d為觀察其游泳姿勢及熟悉環境，讓大鼠自由游泳2min。訓練開始時，將平臺置于NW象限，將大鼠面向池壁從池壁4個起始點的任一點放入水池，入水后系統自動錄像記錄游泳路徑（swimming pathlength）和大鼠找到平臺的游泳時間即逃避潛伏期（escape latency），每天分上、下午兩個時間段（blocks），每個時間段訓練2次（trials），實驗歷時5d，每次大鼠爬上或被引到平臺后，在平臺上休息30s。同一次訓練的全部大鼠采用相同的入水點，每次訓練選取不同入水點。大鼠訓練過程由系統自動記錄，在規定時間內找不到平臺的大鼠，即將其引導到平臺，系統自動中止記錄，并將潛伏期計為150s。訓練結束立即撤出平臺，進行空間搜索實驗，150s內大鼠在穿越原平臺次數、游泳時間百分比、在平臺象限游泳距離、大鼠的搜索策略。

1.6 分子生物學指標 BDNF、TrkB、mRNA：采用半定量（RT－PCR）檢測。全部引物由上海生工合成，BDNF引物序列：上游5′－AGC CTC CTC TGC TCT TTC TGC TGG A－3′，下游5′－CTT TTG TCT ATG CCC CTG CAG CCT T－3′；TrkB 引物序列：上游5′－ATT GAC CCA GAG AAC ATC AC－3′，下游5′－CAG GAA ATG GTC ACA GAC TT－3′；GADPH 為內參照。proBDNF、BDNF及TrkB蛋白：采用蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測。一抗分別采用Chemicom International公司的兔抗鼠proBDNF（AB5613）及Santa Cruz Biotechnology公司的兔抗鼠 BDNF（N－20）：sc－546、兔抗鼠 TrkB，二抗采用Sigma公司的山羊抗兔IgG，采用美國DUPONT的化學增強發光試劑盒（western blot chemiluminescence reagent plus）。操作按分子生物學實驗操作第2版進行。

1.7 統計學處理 實驗數據釆用SPSS12.0統計軟件進行分析。所有計量資料采用±s表示，組內均數的顯著性檢驗釆用單因素方差分析（one way ANOVA），組間均數的顯著性檢驗釆用獨立樣本的t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 雌激素能促進絕經后大鼠海馬表達BDNF mRNA和TrkB mRNA擴增結果 GADPH片斷長度為598bp，BDNF擴增片斷長度為297bp（圖1），TrkB擴增片斷長度為467bp（圖2）。

圖1 大鼠海馬BDNF mRNA擴增產物

圖2 大鼠海馬TrkB mRNA擴增產物

以GADPH內參照單位密度值為10D/mm2，結果經圖像掃描分析，校正后顯示：治療組大鼠海馬BDNF和TrkB mRNA明顯高于對照組，組間比較差異有統計學意義（P＜0.05），組內不同時相點比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 大鼠海馬BDNF、TrkB mRNA相對積分光密度（±s）

表1 大鼠海馬BDNF、TrkB mRNA相對積分光密度（±s）

＊：P＜0.05，與對照組同時間段比較。

組別 時間（d）BDNF TrkB對照組7 0.722±0.047 0.801±0.030 30 0.651±0.096 0.732±0.050雌激素治療組 7 1.006±0.011＊1.175±0.015＊30 0.999±0.015＊1.166±0.018＊

2.2 雌激素能調節絕經后大鼠海馬proBDNF、BDNF及TrkB蛋白表達 免疫印跡結果顯示，TrkB、proBDNF和BDNF蛋白免疫印跡蛋白相對分子質量各為30、14和145kD，結果見圖3～5。

圖3 大鼠海馬BDNF前體及成熟蛋白表達結果（Western blot）

圖4 大鼠海馬BDNF前體蛋白表達結果（Western blot）

圖5 大鼠海馬TrkB蛋白表達結果（Western blot）

以對照組7d這一時相點單位密度值為10D/mm2，結果經圖像掃描分析，校正后顯示：雌激素治療組海馬組織proBDNF、BDNF及TrkB表達水平均明顯高于對照組大鼠（P＜0.05），組內不同時相點差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

2.3 血漿雌二醇水平比較 大鼠血漿雌二醇濃度在雌激素治療7d組為（66.92±10.78）pg/mL，大鼠血漿雌二醇濃度在對照組相應時相點為（3.87±1.94）pg/mL；大鼠血漿雌二醇濃度在雌激素治療30d組為（64.89±10.09）pg/mL，大鼠血漿雌二醇濃度在對照組相應時相點為（5.54±2.37）pg/mL，組內時相點比較差異無統計學意義（P＞0.05），兩組組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 海馬proBDNF、BDNF及TrkB蛋白表達（±s）

表2 海馬proBDNF、BDNF及TrkB蛋白表達（±s）

＊：P＜0.05，與對照組同時間段比較。

組別 時間（d） proBDNF BDNF TrkB對照組7 1.000 1.000 1.000 30 0.951±0.096 1.032±0.050 1.131±0.030雌二醇治療組 7 2.006±0.011＊1.579±0.015＊1.975±0.015＊30 2.099±0.015＊1.661±0.018＊2.166±0.018＊

2.4 兩組大鼠水迷宮試驗成績比較 兩組大鼠定位航行實驗經過水迷宮訓練后游泳速度比較差異無統計學意義（P＞0.05）；組內不同時相點間大鼠游泳速度比較差異無統計學意義（P＞0.05）。說明絕經后大鼠的游泳速度并不能被雌激素替代治療改善。對兩組大鼠潛伏期比較，治療組找到平臺的潛伏期小于對照組（P＜0.05），治療30d的大鼠潛伏期小于治療7d的大鼠（P＜0.05）。說明治療組大鼠記憶力強于對照組，治療30d的記憶力更強（表3）。

表3 雌激素對大鼠定位航行實驗的影響（±s）

表3 雌激素對大鼠定位航行實驗的影響（±s）

＊：P＜0.05，與對照組同時間段比較；★：P＜0.05，與組內7d時比較。

對照組 雌二醇治療組項目n7d 30d潛伏期（s） 10 16.39±4.76 17.06±5.24 12.01±3.18＊8.34±3.03 7d 30d＊★10.75游泳速度（cm/s） 10 35.18±10.2133.52±9.21 34.96±9.54 36.07±

3 討 論

本研究中，雌激素治療組手術后給予雌二醇治療后，治療組體內雌激素水平高于對照組，大鼠找到平臺的潛伏期較對照組短，說明治療組大鼠對平臺的記憶比對照組好，雌激素治療改善了大鼠記憶功能。與Kiss等［7］的研究相符。研究中選取已經絕經的大鼠，主要考慮其雌激素水平較低，即使對照組假手術未切除卵巢，其體內雌激素的水平與治療組給予的雌二醇量比較可以忽略不計，實驗結果能反應雌激素對大鼠記憶的影響。

對雌激素替代治療改善認知功能的機制，研究認為雌激素可能通過抗凋亡、抗氧化、阻止淀粉樣斑的產生及促進神經營養因子分泌［8］，來影響認知功能。有研究表明，大腦中BDNF表達受月經周期影響［9］，提示BDNF的表達受雌激素影響。有關記憶的研究表明，記憶與突觸前和突觸后的長時程增強效應（long－term potentiation，LTP）明確相關，BDNF能調節突觸傳遞和突觸可塑性，改變LTP［10］，增強學習記憶功能。因此，在某種程度上，BDNF可作為記憶改善的分子標志物。

本研究中，雌激素治療組大鼠BDNF基因及蛋白表達均明顯上調，雌激素可能通過促進BDNF表達來影響大鼠的記憶。本研究中，治療組30d時相點大鼠與7d時相點大鼠比較，BDNF的基因和蛋白水平表達并未上調，其體內雌激素濃度也無顯著差異，說明雌激素與BDNF表達一致。治療組定位航行的結果中，30d組大鼠潛伏期比7d組大鼠短，說明30 d組大鼠記憶好于7d組。分析原因：（1）可能是手術創傷對大鼠游泳速度有影響，30d大鼠手術恢復較好，受手術本身的影響較小。（2）一定時間內雌激素持續替代治療時間的長短可能對記憶有一定影響。另外，大鼠的記憶可能還存在其他機制。

BDNF需與其受體結合才能發揮作用，因此，研究BDNF的表達離不開其高親和力受體TrkB，BDNF需要與其結合才能發揮作用，二者在海馬中表達均較高，它們結合后，使TrkB絡氨酸殘基自磷酸化，促發細胞內信號傳導通路，調節LTP［11］，影響學習記憶。TrkB的基因及蛋白表達上調均與BDNF一致，結果從另一方面表明，BDNF及受體TrkB蛋白表達上調，是雌激素記憶的可能機制。在神經元突觸中，BDNF由其前體蛋白proBDNF而來［12］，因此，本研究也檢測了兩組大鼠海馬proBDNF蛋白表達，結果發現，雌激素治療組大鼠proBDNF蛋白增強，與BDNF成熟蛋白表達一致。proBDNF蛋白表達增強也從另一方面表明雌激素能促進BDNF表達，改善學習記憶功能。

本實驗中，雌激素替代治療能改善絕經后大鼠記憶功能，促進BDNF、高親和力受體TrkB及proBDNF蛋白表達，這些蛋白表達的增強，可能是雌激素改善記憶的分子機制之一。

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Estrogen to improve rat memory and hippocampal BDNF protein expression upregulation

TangMingshan
（DepartmentofNeurology，theFirstPeople′sHospitalinBa＇nanDistrict，Chongqing401320，China）

ObjectiveTo explore the relation of estrogen on memory and expression of BDNF in hippocampus of postmenopausal rats.MethodsRats retired from breeding for two reproductive cycles，15－month－old，and 350－400g weight，were divided into two groups by random assigned method.Before testing，estradiol benzoate and the same capacity of normal saline was injected subcutaneouly on the cervical part of rats.memory of rats was detected by Morris water maze.RT－PCR and Western－blot wre respectively used to detect expression of BDNF mRNA，TrkB mRNA and protein of BDNF，TrkB and proBDNF hippocampus of postmenopausal rats.ResultsCompared with the control group，the rats of estrogen replacement therapy group showed a shorter escape latency（P＜0.05）Contrasted to the control group，expression of BDNF，TrkB and proBDNF protein in hippocampus increased（P＜0.05）.ConclusionMemory is enhanced in the rats received estrogen replacement therapy group in postmenopausal rats，it maybe related with high expression of BDNF and relational protein.

estrogen；memory；brain－derived nerve growth factor

10.3969/j.issn.1671－8348.2012.23.016

A

1671－8348（2012）23－2386－03

2012－01－18

2012－02－28）