2型糖尿病大鼠腎臟活性氧物質(zhì)與NO關(guān)系的探討

劉 萍，邱明才，何蘭杰

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科 300052；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，銀川750004）

2型糖尿病大鼠腎臟活性氧物質(zhì)與NO關(guān)系的探討

劉 萍1＃，邱明才1△，何蘭杰2

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科 300052；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，銀川750004）

目的研究糖尿病大鼠腎臟活性氧物質(zhì)與一氧化氮（NO）系統(tǒng)的關(guān)系。方法制備高脂高糖加小劑量鏈脲佐菌素（35mg/kg）誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠模型。將大鼠分為正常對照組10只和糖尿病組20只；觀察糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)及NO系統(tǒng)的表達(dá)，腎功能改變及抗氧化指標(biāo)與NO的相關(guān)性分析。結(jié)果糖尿病大鼠成型12周時SOD，SOD/MDA降低，MDA升高，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；NO、總NOS、iNOS、cNOS均較正常對照組明顯升高。腎臟肥大指數(shù)、尿微量清蛋白、基質(zhì)比、腎小球截面積與SOD/MDA呈負(fù)相關(guān)，與NO、總NOS呈正相關(guān)；SOD/MDA與總NOS、NO之間存在負(fù)相關(guān)。結(jié)論

氧化應(yīng)激，NO均參與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展，它們之間的平衡可能是抗氧化治療在糖尿病腎病中的關(guān)鍵。

糖尿病腎病；活性氧物質(zhì)；一氧化氮

糖尿病腎病（DM）是糖尿病常見并發(fā)癥，活性氧產(chǎn)物（reactive oxygen species，ROS）和一氧化氮（nitric oxide，NO）證實(shí)均參與其發(fā)生、發(fā)展，但抗氧化治療及NO的變化在糖尿病腎病的研究中仍存在很多爭議，現(xiàn)就兩者在糖尿病腎病中的關(guān)系作一探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑

1.1.1 動物及飼料 清潔級近交系雄性Sprague－Dawley大鼠，8周齡，體質(zhì)量180～220g。

1.1.2 試劑 鏈脲佐菌素（STZ）購自Sigma公司；尿微量白蛋白（mALB）試劑購自Beckman公司，由美國Beckman公司ARRAY 360－Protein System（特種蛋白分析儀）測定。超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑購自南京建成生物工程研究所，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，批間CV：3.52%，批內(nèi)CV：1.7%，回收率：103%；丙二醛（MDA）測定試劑購自南京建成生物工程研究所，采用硫代巴比妥酸縮合法（TAB法），批間CV：4.11%，批內(nèi)CV：3.5%，回收率：104%。NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所，采用硝酸還原酶法，批間CV：5.19%，批內(nèi)CV：2.0%，回收率：103%；一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）分型試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批間CV：5.95%，批內(nèi)CV：1.9%，回收率：102%。

1.2 標(biāo)本收集及檢測

1.2.1 分組與收集標(biāo)本 將SD大鼠隨機(jī)分為對照組10只（常規(guī)飼料喂養(yǎng)），實(shí)驗(yàn)組20只（高脂高糖飼料喂養(yǎng)）。高脂高糖喂養(yǎng)8周后，實(shí)驗(yàn)組大鼠空腹腹腔注射STZ 35mg/kg（以pH 4.4，0.1mmol/L枸櫞酸緩沖液配制成20g/L濃度）；對照組僅注射等容積的枸櫞酸緩沖液。注射STZ后1周，用微量血糖儀（羅氏公司提供）監(jiān)測大鼠尾尖血糖，以血糖大于7.8 mmol/L作為糖尿病成型標(biāo)準(zhǔn)。于糖尿病成型12周時處死大鼠進(jìn)行標(biāo)本收集。

1.2.2 儀器 尿微量清蛋白（mALB）由美國Beckman公司ARRAY 360－Protein System（特種蛋白分析儀）測定。

1.2.3 腎臟指標(biāo)檢測 制備腎臟組織勻漿，測定腎臟SOD、MDA含量、NO、總 NOS、iNOS、cNOS含量。

1.2.4 腎臟組織病理檢查 取右側(cè)腎臟，去除腎包膜，4℃生理鹽水充分洗滌，濾紙吸去表面水分，稱重。相對腎重（也稱腎肥大指數(shù)，腎重/體質(zhì)量）。于4℃生理鹽水玻璃器皿中將腎臟自腎門冠狀面縱行剖開，存放于10%中性甲醛液中固定，常溫避光保存，行普通病理HE染色及PAS染色，應(yīng)用北航CMIAS多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)中的腎小球分析模塊進(jìn)行腎小球面積及腎小球基質(zhì)比的分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。所有計量資料均以±s表示。兩組資料比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各指標(biāo)的相關(guān)性分析采用多因素相關(guān)回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1 糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)的觀察 STZ注射糖尿病大鼠成型12周時，SOD、SOD/MDA均較正常對照組降低，MDA升高，見表1。

2.2 糖尿病大鼠腎臟NO系統(tǒng)的觀察 STZ注射糖尿病大鼠成型12周時，實(shí)驗(yàn)組腎臟NO、總NOS、iNOS、cNOS均較正常對照組明顯升高（表2）。

2.3 糖尿病大鼠腎臟功能及形態(tài)學(xué)定量分析的觀察 STZ注射糖尿病大鼠成型12周時實(shí)驗(yàn)組腎肥大指數(shù)、尿微量清蛋白、腎小球截面積、腎小球基質(zhì)面積均較正常對照組明顯增高（表3）。

表1 兩組大鼠腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)的比較（±s）

表1 兩組大鼠腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)的比較（±s）

＊：P＜0.01，與正常組比較。

組別nSOD（NU/mg）MDA（nmol/mg）SOD/MDA（NU/nmol）正常對照組10 257.71±15.56 1.44±0.13 179.5±17.18實(shí)驗(yàn)組 20 225.46±9.55＊1.68±0.20＊136.40±23.7＊

表2 兩組大鼠腎臟NO、NOS的比較（±s）

表2 兩組大鼠腎臟NO、NOS的比較（±s）

＊：P＜0.05，＃：P＜0.01，與正常對照組相比。

組別 NO（μmol/g） NOS（U/mg） iNOS（U/mg） cNOS（U/mg）正常對照組0.21±0.05 0.33±0.11 0.12±0.08 0.21±0.12實(shí)驗(yàn)組 0.46±0.17＃0.70±0.12＃0.30±0.09＃0.40±0.29＊

±s）表3 兩組大鼠腎臟功能及形態(tài)學(xué)定量比較（

±s）表3 兩組大鼠腎臟功能及形態(tài)學(xué)定量比較（

＊：P＜0.01，與正常對照組比較。

組別 腎肥大指數(shù)（mg/g） 尿mALB（mg/L） 腎小球截面積（μm2） 腎小球基質(zhì)面積（μm2）正常對照組 3.37±0.26 2.23±0.50 6 058.94±327.36 1 876.16±164.46實(shí)驗(yàn)組 5.47±0.67＊8.45±2.80＊10 422.13±1 001.51＊4 502.09±471.94＊

2.4 腎臟影響因素 腎臟肥大指數(shù)、尿微量清蛋白、基質(zhì)比、腎小球截面積與SOD/MDA呈負(fù)相關(guān)，與NO、總NOS呈正相關(guān)；SOD/MDA與總NOS、NO之間呈負(fù)相關(guān)（表4）。

表4 腎臟影響因素相關(guān)性分析

3 討 論

氧化應(yīng)激是指ROS超出局部的抗氧化能力所表現(xiàn)的細(xì)胞毒作用，對蛋白質(zhì)、脂肪和核酸均具有損害作用［1］。糖尿病時以糖代謝紊亂為主的多種因素介導(dǎo)的氧自由基產(chǎn)生過多在機(jī)體各組織中均有反應(yīng)。腎組織中的氧化/還原平衡狀態(tài)被破壞，造成腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)［2－3］。Hiroki等［4］研究表明糖尿病大鼠腎臟SOD1、SOD3的表達(dá)下調(diào)在糖尿病腎病的發(fā)病中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示糖尿病成型12周時SOD明顯降低，MDA升高，SOD/MDA降低，與正常大鼠相比存在顯著性差異，說明糖尿病大鼠腎臟存在氧化應(yīng)激。腎臟抗氧化能力與腎功能指標(biāo)相關(guān)性分析表明SOD/MDA與mALB、腎肥大指數(shù)、基質(zhì)比、腎小球截面積呈顯著負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步證明氧化應(yīng)激參與了糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。

NO是一種具有廣泛生理活性的旁分泌調(diào)節(jié)劑，在血管收縮、抗血栓形成、細(xì)胞調(diào)控、神經(jīng)介質(zhì)傳遞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。NO產(chǎn)生于L－精氨酸（L－Arg）的末端，反應(yīng)需要NOS的催化。NOS有3種亞型，即神經(jīng)元型NOS（ncNOS）、內(nèi)皮型 NOS（ecNOS）和誘導(dǎo)型 NOS（iNOS）。ec－NOS和ncNOS合稱為結(jié)構(gòu)型NOS（cNOS），為Ca2＋/鈣調(diào)素依賴性在生理狀態(tài)下催化生成少量NO，主要參與中樞或外周對血管的舒張調(diào)節(jié)作用。iNOS為非Ca2＋依賴性，（盡管在Ca2＋存在的情況下也能增強(qiáng)iNOS活性），在病理情況下當(dāng)受到內(nèi)毒素和某些細(xì)胞因子的刺激時能誘導(dǎo)生成大量NO，參與炎癥反應(yīng)過程［5－6］。NO作為較強(qiáng)的血管舒張因子在血流動力學(xué)方面已作了大量的研究，然而學(xué)者們在對NO與糖尿病腎病的關(guān)系探討中卻得到很多相互矛盾的結(jié)論.有學(xué)者報道糖尿病腎病患者腎臟內(nèi)皮型NOS表達(dá)增高，從而NO活性是被激活的，參與了腎小球高濾過狀態(tài)及系膜基質(zhì)的增生［7－8］。而Ishii等［9］和Tessari等［10］卻得到糖尿病腎病時NOS的表達(dá)是下降的結(jié)論。Atul等［11］學(xué)者也對高脂喂養(yǎng)2周再注射小劑量STZ后6周的糖尿病大鼠進(jìn)行研究表明，大鼠體內(nèi)的NO水平是降低的，而且是通過影響解偶聯(lián)的內(nèi)皮型NOS的作用來實(shí)現(xiàn)的。Radko和Anderson［12］通過對大量研究結(jié)果的薈萃分析提出：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)得出NO升高或下降的結(jié)論與所觀察的DM的特定時期有關(guān)，NO升高者多處于DM早期，而NO下降者則多表現(xiàn)在DM的晚期，進(jìn)而推斷DM內(nèi)皮源性舒張功能紊亂隨糖尿病病程而改變，表現(xiàn)為初期升高－中期代償性正常－晚期下降的趨勢。本實(shí)驗(yàn)表明高脂高糖加STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠12周時，腎臟總NOS、iNOS、cNOS及NO較正常組均明顯增高，總NOS、NO與mALB、腎肥大指數(shù)、基質(zhì)比、腎小球截面積呈正相關(guān)。結(jié)合尿mALB、腎臟形態(tài)學(xué)改變判定糖尿病大鼠12周時，尚處于糖尿病腎病早中期，仍以腎臟高血流量、高濾過為主，與NO，NOS的表達(dá)相一致，證明NOS、NO參與了糖尿病腎病早期的發(fā)病，且iNOS、cNOS均參與了NO的生成。隨著病程的發(fā)展，可能會出現(xiàn)Radko和Anderson［12］總結(jié)的NO雙相調(diào)節(jié)機(jī)制。

高血糖誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，ROS能夠激活NOS產(chǎn)生NO，同時解偶聯(lián)的NOS在生成NO的時候，也產(chǎn)生超氧陰離子，因此解偶聯(lián)的NOS是糖尿病血管ROS產(chǎn)生的重要來源，加重氧化應(yīng)激狀態(tài)［13］。當(dāng)局部NO濃度升高又可與周圍的氧自由基等反應(yīng)而生成活性氮族（reactive nitrogen species，RNS），此反應(yīng)速度極快，且反應(yīng)不可逆，只要兩者相遇即可生成ONOO－，速度是超氧歧化酶的6倍，NO是ROS強(qiáng)大的清除劑，與此同時NO的水平也是下降的，因此RNS和ROS的生成和清除是重疊的，且彼此是互相調(diào)節(jié)的［14－15］。本實(shí)驗(yàn)顯示SOD/MDA與總NOS、NO之間存在負(fù)相關(guān)提示腎臟抗氧化能力減低與NOS、NO有關(guān)。這可能與不同生理病理狀態(tài)下二者之間的代謝平衡有關(guān)。

很多動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗氧化治療對心腦血管疾病有效，但大多人體實(shí)驗(yàn)研究效果并不令人滿意［16］。ROS和NO雖然在糖尿病腎病可作為獨(dú)立的發(fā)病因素存在，兩者之間也有著密切的聯(lián)系，但其作用效果仍不清楚，分析其原因可能是多因素效應(yīng)不能均衡的結(jié)果。不僅僅是ROS和NO之間的平衡，更是腎臟細(xì)胞內(nèi)氧化狀態(tài)和抗氧化狀態(tài)的平衡，有待于進(jìn)一步探討。

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The relation between the reactive oxygen species and nitric oxide of diabetic nephropathy in type 2 diabetic rats

LiuPing1＃，QiuMingcai1△，HeLanjie2
（1.DepartmentofEndocrinology，GeneralHospitalofTianjingMedicalUniversity，Tianjing300052，China；2.DepartmentofEndocrinology，AffiliatedHospitalofNingxiaMedicalUniversity，Yinchuan，Ningxia750004，China）

ObjectiveTo study the relation between the reactive oxygen species and nitric oxide（NO）of diabetic nephropathy in type 2diabetic rats.MethodsMaking type 2diabetic rats by high－sucrose－h(huán)igh－fat diet with a low dose of STZ（35mg/kg）injecting into abdominal cavity.The rats divided into control group（n＝10）and diabetic group（n＝20）.The expression of oxidative stress and Nitric Oxide system in diabetic nephropathy were observed and the correlation of oxidative index，Nitric Oxide and renal function was analyzed.ResultsIn diabetic rats，SOD，SOD/MDA were reduced in comparison with control group while MDA was increased.NO，Total NOS，iNOS，cNOS were elevated in diabetic group；the kidney weight/body weight，urine microalbumin，mean glomerular area，mean mesangial matrix area/mean glomerular area ratio negatively correlated with SOD/MDA，while positively correlated with NO，total NOS；SOD/MDA negatively correlated with NO，total NOS.ConclusionThe oxidative stress and NO participate in the diabetic nephropathy，the balance is the key point that the treatment of antioxidant in the diabetic nephropathy probably.

diabetic nephropathy；reactive oxygen species；nitric oxide

10.3969/j.issn.1671－8348.2012.23.017

A

1671－8348（2012）23－2389－03

＃該作者就職于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，現(xiàn)為天津醫(yī)科大學(xué)內(nèi)分泌專業(yè)在讀博士。△ 通訊作者，Tel：13512019540；E－mail：mingcaiqiu＠vip.sina.com。

2011－11－07

2012－02－16）