新型納米抗菌無機填料的合成及其抗菌性能的初步研究

吳峻嶺 金嬋媛 聶曉萌 周凱運 周傳建

（1.山東大學口腔醫院 口腔修復科；山東省口腔生物醫學重點實驗室，濟南 250012；2.山東大學材料科學與工程學院 高分子材料研究所，濟南 250061）

現有的絕大多數牙科復合樹脂材料因沒有抗菌性能，容易造成充填修復后患牙的繼發齲、牙髓炎癥等并發癥，如何賦予復合樹脂材料抗菌、防齲性能，有效抑制微生物、菌斑在其表面及周圍的滋生和附著，提高臨床治療效果，是牙科材料的研究熱點[1]。為了實現上述目的，研究者從不同方面進行了嘗試，如通過直接向樹脂基體中加入抗菌成分，或通過在樹脂基質上鍵合抗菌官能團等方法，來抑制細菌滋生等[2-3]。這些方法雖取得了一定的效果，但如何進一步提高樹脂的抗菌性能依然是擺在研究者面前的一個課題。季銨鹽作為一類廣譜抗菌化合物，在抗菌領域具有廣泛的應用，將高分子季銨鹽與無機顆粒復合可以制成非緩釋型抗菌材料[4]。如果將具有抗菌作用的無機填料添加到樹脂中去，牙科樹脂的抗菌性能將得到改善；另外，通過對季銨鹽結構的設計還可以實現對某些菌類的專一抑制，這更有利于開發新型抗菌牙科樹脂。納米二氧化硅在樹脂中具有良好的分散性和耐磨性，在其表面還存在部分活性羥基，非常有利于表面修飾。

基于此，如果將抗菌性能好、效果持久、毒性低的季銨鹽結構作為抗菌成分，以適當的方法將其鍵合于納米二氧化硅表面，形成抗菌顆粒，再添加到樹脂基體中去，賦予牙科復合樹脂優異抗菌、防齲性能，則有望解決傳統復合樹脂在實際臨床應用過程中無抗菌防齲性能的弊端，滿足臨床需要。本研究旨在通過一系列方法制備表面枝接季銨鹽化合物的納米SiO2抗菌顆粒，并研究其特性，為實現牙科復合樹脂抗菌性能提供新的途徑。

1 材料和方法

1.1 主要材料及設備

M5型納米二氧化硅（卡博特公司，美國）：純度99.99%，粒徑20 nm。變異鏈球菌ATCC 25175（四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供），TSA、TSB培養基（北京奧博星生物技術有限責任公司），DF101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（西安愛信儀器有限公司），RE-52CS2型旋轉蒸發器（上海隆拓儀器設備有限公司），AVATAR 360型傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet公司，美國）。

1.2 目標產物的設計與合成

在參考相關研究[5-6]的基礎上，制定了有機合成的思路：將含有機硅基團的γ-氯丙基三甲氧基硅烷碘代后與三乙胺反應形成季銨碘鹽，再枝接到納米二氧化硅表面，生成季銨鹽修飾納米二氧化硅抗菌顆粒。

1.2.1 N,N,N-三甲基-3-（三甲氧基硅基）丙基-1-碘化銨的制備 將γ-氯丙基三甲氧基硅烷、碘化鈉按照摩爾比1.1∶1的比例加入裝有溫度計、磁力攪拌棒、冷凝裝置、氮氣密封的四口燒瓶中，以乙醇作為溶劑，加熱至80℃并使乙醇回流1～2 h，然后按照硅烷與叔胺摩爾比為1∶1的比例加入三乙胺，繼續回流36 h。真空抽濾，再減壓蒸餾，得到淡黃色黏稠液體，即季銨鹽：N,N,N-三甲基-3-（三甲氧基硅基）丙基-1-碘化銨。

1.2.2 季銨鹽修飾納米二氧化硅的制備 按每0.05mol的季銨鹽需加入3 g二氧化硅的比例，將制備好的季銨鹽與納米二氧化硅顆粒以及溶劑乙醇一并加入裝有溫度計、磁力攪拌棒、冷凝裝置、氮氣保護的四口燒瓶中，加熱攪拌回流反應6 h，蒸出溶劑，將剩余物用濾紙包好，放入索氏抽提器中，用乙醇萃取24 h，取出并烘干，得到季銨鹽修飾納米二氧化硅顆粒。

1.3 季銨鹽及季銨鹽修飾納米二氧化硅結構的表征

采用紅外光譜分析進行合成產物的結構表征和鑒定。液體（季銨鹽）采用涂膜法；固體（季銨鹽修飾納米二氧化硅顆粒）采用KBr壓片法，同時選擇表面未枝接季銨鹽化合物的納米二氧化硅顆粒作為對照。測試條件為：掃描次數32，分辨率4 cm-1。

1.4 抗菌性能的檢測

采用培養法定性檢測目標產物的抗菌性能。根據預實驗的結果，實驗組取0.1 g季銨鹽修飾納米二氧化硅顆粒，加入到100 mL TSA培養基中，超聲充分震蕩分散后，于培養皿內鋪板。對照組則不添加任何成分，過程同上。調整TSB液體培養基中隔夜培養的變異鏈球菌菌懸液濃度至2.4×108CFU·mL-1，將原液用10倍系列稀釋法稀釋為原液的1/100 000，作為實驗用菌懸液。取實驗用菌懸液0.1 mL，分別接種于實驗組和對照組TSA固體培養基表面，微需氧（80%N2、10%CO2、10%H2）培養48h，菌落計數。為減少實驗過程中的誤差，每組做5個平行試驗，所有操作均由同一人完成。

1.5 統計分析

采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行校正t檢驗分析。

2 結果

2.1 紅外光譜分析

季銨鹽的表征與鑒定：圖1為季銨鹽N,N,N-三甲基-3-（三甲氧基硅基）丙基-1-碘化銨的紅外光譜圖，在1 385.80 cm-1處出現了與正氮離子相連的-CH2（即季銨基團中的C-N鍵）的特征吸收峰，是發生季銨化反應生成季銨鹽的重要證據；同時在2 970.86 cm-1處為-CH的振動吸收，在3 342.20 cm-1處為Si-OH的吸收，說明在反應過程中有部分的硅烷氧基發生了水解，這些都證明反應生成的產物為季銨鹽。

季銨鹽修飾納米二氧化硅的表征與鑒定：圖2為季銨鹽修飾的和未修飾的納米二氧化硅顆粒的紅外光譜圖，曲線2在3 427.89 cm-1處出現較強的吸收峰，是二氧化硅顆粒表面羥基的吸收峰；而曲線1在3 427.89 cm-1處的峰明顯減弱，是由于二氧化硅顆粒表面的羥基與硅烷氧基發生反應而減少，同時在2 973.21 cm-1處出現烷基的吸收，這些都說明季銨鹽已經鍵接到二氧化硅顆粒表面。

2.2 抗菌性能

實驗組與對照組的菌落計數分別為148.40±11.41和17.40±2.88，因兩組方差不齊，故采用校正t檢驗分析，結果顯示實驗組抗菌效果明顯（t’=24.88，P＜0.01），說明季銨鹽修飾納米二氧化硅顆粒對變異鏈球菌有較強的殺菌性能，具有良好的抗菌性。

圖 1 季銨鹽紅外分析光譜圖Fig 1 Infrared spectrum analysis figure of quaternary ammonium salt

圖 2 季銨鹽修飾的和未修飾的納米二氧化硅顆粒的紅外光譜圖Fig 2 Infrared spectrum analysis figure of nano-silica particle grafted and no grafted with quaternary ammonium salt

3 討論

3.1 牙科復合樹脂抗菌性研究現狀

如何使現有的牙科復合樹脂材料具有抗菌性能，是當前口腔材料學領域研究的一個重要方向。學者主要從添加抗菌劑和組分改性兩個方面進行了探索。添加抗菌劑主要是通過向樹脂基質中加入無機或有機抗菌成分，然后通過抗菌成分的緩慢釋放來達到抗菌的目的。如Bürgers等[2]將銀顆粒添加到牙科復合樹脂中，不但降低了變異鏈球菌在試件表面的黏附，而且顯示了良好的抗菌性能。但是抗菌劑釋放時會存在藥物的溶出使基體材料的物理結構受到破壞而機械性能降低。有報道[7]顯示，向復合樹脂中添加一定量的氯己定雖然會賦予其抗菌性，但是同時也降低了材料的機械強度，這可能與抗菌因子的溶出造成了材料的多孔結構有關。此外，機械添加抗菌成分還存在藥物釋放的持久性不足、抑菌效果下降、時效性短，甚至是抗菌顆粒的釋放而帶來潛在毒性的弱點。樹脂組分改性則是在樹脂單體上鍵合季銨鹽、苯酚等有機抗菌官能團，形成非溶出性抗菌劑，抗菌官能團與樹脂單體靠化學鍵連接，直接對黏附在樹脂表面的細菌發揮作用，而不需要通過釋放抗菌因子來達到抗菌效果，所以性能穩定，效果持久，幾乎不存在因抗菌成分的釋放而導致的毒性問題。在所有的有機抗菌官能團中，季銨鹽化合物因抗菌范圍廣和抗菌效果好而經常被大家選用[8]。如Imazato等[3]首次將季銨鹽類抗菌分子12-甲基丙烯酰氧烷基溴化吡啶鹽鍵合到樹脂基質單體上，制成非溶出性抗菌樹脂。這種非溶出性抗菌材料的一大優點是抗菌作用持久且不影響材料的機械性能。盡管非溶出性抗菌樹脂抗菌效果持久，但是由于抗菌成分鍵合到樹脂基質單體上，在某種程度上仍然會影響到樹脂基質單體的化學性質，減弱其固化的性能等[9]。綜合國內外上述的研究基礎，探索新的賦予牙科樹脂抗菌性能的方法勢在必行。無機填料作為復合樹脂的另一個重要組成成分，其作用就是賦予材料良好的物理機械性能，減少樹脂的聚合收縮等。若在其表面鍵合具有抗菌性的季銨鹽化合物，再添加到樹脂基體中，這樣既可以保證不改變樹脂基質單體的化學特性，同時又賦予牙科復合樹脂抗菌防齲性能，這是牙科樹脂抗菌性研究的又一個新的創意和嶄新的思路。

3.2 新型納米抗菌無機填料的合成及抗菌性能

季銨鹽化合物是由銨離子中的4個氫原子被烴基取代而成，通式為（R4N）+X-，其中R為4個烴基，X多為鹵族元素離子。如何將季銨鹽的結構與二氧化硅的結構相結合是本研究要解決的首要問題，考慮到二氧化硅表面的羥基具有一定的活性，可以與烷氧基硅烷反應，從而實現化學鍵合，因此，本研究采用叔胺與烷氧基硅烷取代反應的途徑。在本研究中，首先以γ-氯丙基三甲氧基硅烷為原料，與碘化鈉反應，將氯原子取代為碘原子，而后合成了季銨碘鹽：N,N,N-三甲基-3-（三甲氧基硅基）丙基-1-碘化銨，并由紅外光譜分析（圖1）得到了證實。而N,N,N-三甲基-3-（三甲氧基硅基）丙基-1-碘化銨中的甲氧基又與納米二氧化硅粉體表面發生偶合反應，使得季銨碘鹽牢固地枝接到二氧化硅顆粒表面，由圖2可見，二氧化硅表面未枝接季銨鹽基團之前存在大量的羥基（曲線2），而與季銨鹽偶合以后羥基數量顯著減少（曲線1）；同時由于新合成的季銨碘鹽溶于有機溶劑，經過乙醇萃取后，未鍵合到二氧化硅顆粒表面的季銨碘鹽會被溶解掉，這些都說明生成的季銨鹽改性的納米二氧化硅顆粒是一個牢固的整體，抗菌顆粒中的季銨鹽與二氧化硅載體通過化學鍵緊密地結合在一起，不易脫落。若將其添加到復合樹脂中去，可以隨著樹脂基體的磨耗，持續地發揮抗菌作用，這樣既不影響樹脂基質的化學特性，還能有效地克服機械添加抗菌成分存在的藥物釋放持久性不足、時效性短等弊端。

許多微生物細胞膜上的磷脂因氧化而帶有負電荷，而帶正電荷的季銨鹽分子十分容易穿過網狀多孔的細胞壁，并破壞細胞膜的完整性，使胞內維持生命活動所需的大分子如RNA、DNA、K+等釋放出來，最終導致細菌死亡。Beyth等[10]直接將納米級的季銨鹽顆粒添加到復合樹脂中，對變異鏈球菌顯示了良好的抗菌性能，而肖玉鴻等[11]將季銨鹽枝接到牙科常用的單體甲基丙烯酸酯基團上，制備出不同種類的牙用季銨鹽類抗菌單體，對變異鏈球菌等細菌亦顯示了良好的抗菌性。在本研究中，將自行合成的納米抗菌無機填料季銨鹽修飾納米二氧化硅添加到細菌培養基中，并以齲病的常見致病菌變異鏈球菌作為研究對象，結果表明，與對照組相比，季銨鹽修飾納米二氧化硅顯示了良好的抗菌性能（P＜0.01）。

當前，如何賦予牙科復合樹脂長久的抗菌防齲性能，提高臨床治療效果，仍然是研究的熱點和難點。本研究在參閱國內外最新相關研究進展的基礎上，通過一系列的有機方法自行合成了季銨鹽：N,N,N-三甲基-3-（三甲氧基硅基）丙基-1-碘化銨，并成功地枝接到納米二氧化硅顆粒上，生成了納米抗菌無機填料：季銨鹽修飾納米二氧化硅顆粒。經紅外光譜分析證實，該方法簡便有效。同時，還以變異鏈球菌為研究對象，定性分析了抗菌無機填料的抗菌性能，并且得到了有益的結論，為以后此方面的研究開辟了新的思路。

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