綠茶提取物表沒食子兒茶素沒食子酸酯對酸蝕癥牙本質膠原降解作用的初步研究

陳黃琴 黃彬

（湖北科技學院 口腔教研室，咸寧 437100）

牙齒酸蝕癥是指在沒有細菌參與的情況下，由于酸的化學侵蝕或螯合作用，牙體表面硬組織局部性、病理性、慢性進行性喪失的一種疾病[1]。釉質酸蝕表現為一種向心性的礦物質溶解過程，直至暴露釉質下方的牙本質。脫礦牙本質中，有機質的存在能阻擋離子的擴散，減少酸蝕底物的喪失[2]，并能保護剩余的脫礦牙本質抵擋刷牙等機械性磨損[3]。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類含Zn2+和Ca2+的蛋白水解酶，是酸蝕癥過程中降解牙本質有機質的主要蛋白水解酶之一。鑒于保存脫礦的牙本質有機質有利于減緩酸蝕癥的發展，尋找、使用MMPs抑制劑，通過降低有機質的降解間接影響酸蝕進程就顯得十分重要。綠茶多酚，特別是表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是MMPs的天然抑制劑，對多種腫瘤細胞系的MMP-2和MMP-9有明顯的抑制作用[4]。本試驗采用雙盲隨機對照的方法，在自然口腔生態環境下，研究天然藥物EGCG對牙本質抗酸蝕作用的影響。為開發天然藥物防治酸蝕癥提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料及配制方法

EGCG（質量分數為98%，Sigma公司，美國）。Ⅰ型膠原羧基端肽（carboxy-terminal telopeptide of typeⅠcollagen，ICTP）的檢測設備γ放射免疫計數儀（FJ-2008PS型，西安核儀器廠）由咸寧市中心醫院放射免疫科提供。

EGCG凝膠的制備：先將EGCG溶于去離子水中，一次性抽濾器抽濾消毒，備用。將羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose sodium，CMC）在持續攪拌的狀態下緩慢均勻地分散到去離子水中，待其完全溶解，濾去雜質后，高溫高壓消毒備用。再將消毒過的CMC水凝膠放置在振蕩器上，邊振蕩邊逐滴滴加EGCG溶液，直至兩者充分混合，EGCG和CMC的終質量分數分別為1%和2%。安慰劑凝膠（CMC凝膠）制法同上，只是不添加EGCG溶液。共制備凝膠制品64份，每種各32份。每個凝膠制品包裝一致，只是編號不同。只有負責編號的老師知道不同編號對應的凝膠種類，此人不再參與本試驗的其他內容。

1.2 研究對象

研究對象為湖北科技學院在校大學生，年齡18～22歲。研究者利用新生體檢數據，根據Eccles和Jenkins[5]提出的牙齒酸蝕癥診斷標準和O’Sullivan[6]提出的牙齒酸蝕癥評分指數，選取酸蝕癥志愿者64名為研究對象，其中男生35名，女生29名。64名志愿者的酸蝕癥損害為釉質缺失、牙本質暴露（釉牙本質界可見），或者釉質和牙本質缺失達牙本質深層，即酸蝕指數為3～4分。所有志愿者均無活動性齲、無牙齦出血、無系統性疾病，近2周無服藥史。試驗前征得所有學生的同意，并簽署知情同意書。

1.3 研究方法

1.3.1 個別托盤的制作及使用 將成品熱固化成形牙套放入沸騰的熱水中約5 s，使其軟化，將水甩干后將軟的牙套放入志愿者口中，用手指緊壓牙齒的舌面、唇側和咬合面，同時用舌頭頂住內面擠出里面的空氣和水，15 s后取出放進冷水中使牙套凝固。用小剪刀剪去牙齦以下的部分即制作完成。使用時，在托盤3┼3的區域注入1 mL凝膠，放入口中輕輕咬合，使得凝膠均勻分布在各個牙面。要求志愿者在睡時使用，第2天清晨起床后取下（每天戴用約8 h）。

1.3.2 培養液的收集及檢測 取出托盤后，立即在托盤內注入0.01 mol·L-1的PBS緩沖溶液1 mL，放在搖床上輕輕搖晃10 min，收集上下頜托盤內的PBS溶液裝入試管中，置于漩渦振蕩器上振蕩1 min使其充分混合。從混合溶液中吸取100 μL，使用芬蘭Orion Diagnostica公司提供的ICTP放射免疫試劑盒測定ICTP的質量濃度。

1.4 試驗設計

試驗開始前2周，給每位志愿者發放無氟牙膏，要求志愿者每天早晚2次用其刷牙，同時隨機分發帶有不同編號的凝膠制品。試驗組和對照組各32名，分別使用EGCG凝膠和CMC凝膠。試驗開始前1 d，收集培養液進行ICTP基線測量，這時托盤中注入的是CMC凝膠，以后每日使用隨機分發的帶有編號的凝膠，持續4周。于試驗的第1、2、3、4周清晨收集培養液，進行ICTP質量濃度的測定，方法見1.3.2。

1.5 統計分析

采用SPSS統計學軟件13.0處理數據，各組均數的比較用單因素方差分析和Newman-Keul法進行統計分析。

2 結果

試驗組和對照組在不同的觀察時間點測定的ICTP質量濃度見表1。由表1可見：凝膠的種類和使用時間對ICTP的質量濃度均有影響。對照組（CMC凝膠組）ICTP的質量濃度隨著時間的增長呈現上升趨勢（P＜0.05），到第3周趨于平穩，3、4周ICTP質量濃度的差異沒有統計學意義（P＞0.05）。試驗組（EGCG凝膠組）ICTP的質量濃度則呈現出隨時間增長而下降的趨勢（P＜0.05），到第3周時也基本趨于穩定，3、4周的差異無統計學意義（P＞0.05）。對于同一時間點試驗組和對照組ICTP質量濃度進行比較，除了2組的基線測量值沒有差異（P＞0.05）之外，其余各時間點的差異均有統計學意義（P＜0.05），對照組均高于試驗組。

表 1 不同時間點對照組和試驗組的ICTP測量結果Tab 1 ICTP values at different time points in the control and experimental groups μg·L-1

3 討論

近年來，流行病學調查[7]表明：酸蝕癥在人群中普遍存在，且發病率呈上升趨勢。有學者[8]調查了我國1 949名3～5歲學齡前兒童的上頜切牙，發現有112名（占5.75%）患有牙酸蝕癥。酸蝕癥可引起牙齒的釉質損害，嚴重者可侵犯牙本質和牙髓，導致牙齒過敏，甚至牙髓暴露及牙齒折斷。目前，臨床上常用的治療酸蝕癥的藥物主要是氟化物及其衍生物，然而隨著局部應用氟化物濃度、頻率的增加以及多種氟化物制劑的廣泛使用，易導致耐氟菌株的選擇性生長，使其臨床應用受到一定的限制[9]。因此，研究開發能有效阻止因酸蝕造成的牙體硬組織慢性損傷的藥物顯得十分重要。酸蝕癥是一個多因素的疾病，與頻繁消費酸性飲料及食物、患某些疾病使胃酸頻繁進入口腔內接觸牙齒等有一定的關系。本試驗選取的研究對象是在校大學生，一般無頻繁嘔吐、反胃等現象，造成酸蝕癥的原因主要是頻繁消費酸性飲料，因而降解牙本質有機質的蛋白水解酶主要是MMPs而不是胃蛋白酶和胰蛋白酶。已有研究[4]證實：EGCG能顯著抑制MMP-2和MMP-9的活性。另有學者[3]發現：與水相比，用綠茶漱口能減少酸蝕或磨耗情況下牙本質的磨損。因此，選用EGCG作為研究藥物理論上是可行的。

本試驗選擇ICTP作為衡量膠原降解程度的指標。ICTP是由MMPs介導的成熟的Ⅰ型膠原（牙本質有機質的主要成分）降解過程中產生的特異性物質。檢測ICTP水平是定量分析MMPs降解Ⅰ型膠原酶活性最可靠的方法之一。在已知的與硬組織吸收有關的膠原降解蛋白酶中，只有MMPs能夠產生ICTP，其釋放只能被MMPs抑制劑特異性抑制，而不能被半胱氨酸蛋白酶抑制劑所抑制，因此檢測ICTP的敏感性、特異性遠遠高于檢測膠原其他片段如羥脯氨酸等。本試驗結果顯示，凝膠中添加EGCG使得ICTP的質量濃度呈現下降趨勢，與對照組相比差異有統計學意義，說明EGCG能夠降低牙本質有機質的降解，從而具備減緩牙本質酸蝕進程的潛能。EGCG能減少酸蝕癥患牙培養液中ICTP質量濃度的原因主要有兩個。1）EGCG含有3,4,5-三羥苯甲酰基團，能通過氫鍵和多酚疏水作用穩定膠原。研究[10]證實：EGCG比一般的化學交聯劑如戊二醛、碳化二亞胺更能穩定膠原，保護膠原鏈不被膠原酶降解。2）EGCG能直接抑制MMP-2和MMP-9的活性。MMP-2和MMP-9是降解牙本質膠原主要的蛋白水解酶。酸蝕發生時，牙本質脫礦，由于唾液的緩沖作用使酸蝕環境由酸性逐漸變成中性，在此變化過程中牙本質有機質的膠原纖維暴露，暴露的膠原蛋白首先被MMP-8剪切成片段，然后被MMP-2和MMP-9進一步降解[11]。因此，EGCG作為MMP-2和MMP-9的抑制劑，能有效降低牙本質膠原的降解。對照組ICTP的含量表現為逐步上升的趨勢，推測其主要原因是由于唾液的流動性和緩沖能力等因素對釉質酸蝕有一定的保護作用[12-13]。唾液中的鈣磷濃度處于過飽和狀態，能夠在釉質酸蝕早期彌補礦物質的喪失，而且唾液中的氟可通過形成氟磷灰石樣結構增強表面溶解晶體的再礦化，比羥磷灰石更好地抵抗酸蝕作用[14]。對照組中雖然沒有使用EGCG，但是含有CMC凝膠的托盤大大減少了唾液與牙面的直接接觸，從而降低了唾液及唾液獲得性膜對牙齒酸蝕的保護作用，因此，對照組ICTP的含量表現為逐步上升的趨勢。綜上所述，EGCG能有效減少脫礦牙本質膠原的降解，提高牙本質抗酸蝕的能力，具有進一步研究、開發的潛能。

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