HPLC法測定新疆準噶爾烏頭中雙酯型生物堿

趙翡翠， 何 強， 李 杰

(1.新疆醫科大學附屬中醫醫院藥學部，新疆烏魯木齊 830000;2.新疆醫科大學中醫學院，新疆烏魯木齊 830054)

準噶爾烏頭為毛茛科植物準噶爾烏頭Aconitum soongaricumStapf的干燥塊根，主要產于我國新疆北疆地區，民間常做草烏的代用品使用，味辛、苦，大熱，有毒，具祛風散寒、止痛消腫、通經活絡的功效［1］。新疆地域遼闊，干旱高寒，生態環境惡劣，使風濕類疾病成為新疆地區常見病、多發病，且纏綿難愈，準噶爾烏頭在治療此類疾病方面，有其獨特的優勢［2］。同時，準噶爾烏頭也是近年來生長于新疆草場的主要毒害草之一，已對新疆畜牧業造成較大的危害。因此，有必要盡快對準噶爾烏頭的藥用價值進行研究。據文獻報道［3-4］，準噶爾烏頭中含有準噶爾烏頭堿、12-表-歐烏堿及12-表-脫氫歐烏堿，而準噶爾烏頭是否含有大多數烏頭屬植物中所含的活性成分——雙酯型生物堿 (烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿)尚未見報道，這將使進一步研究準噶爾烏頭炮制減毒、藥理作用受到很大程度的限制。因此，本實驗采用HPLC方法測定準噶爾烏頭中的活性成分，為新疆準噶爾烏頭藥用植物資源的進一步開發和利用奠定基礎。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀 (美國Waters公司);AG—135電子分析天平 (梅特勒-托利多儀器有限公司);SK3300LH超聲清洗器 (上海科導超聲儀器有限公司);Direct—QTM5超純水儀(Millipore公司)。烏頭堿 (批號110720-200410)、新烏頭堿 (批號110799-200404)和次烏頭堿 (批號110798-200404)均購于中國藥品生物制品檢定所，其他試劑均為分析純。

川烏樣品分別購自安徽省亳州市雙華中藥飲片廠 (批號101001，產地:四川)、安徽省亳州市凱利中藥飲片有限公司 (批號091210，產地:四川)、新疆奇康哈博維藥有限公司 (批號20110501，產地:四川)，以上樣品經新疆醫科大學附屬中醫醫院中藥藥學實驗室李永和主任中藥師鑒定均為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.的干燥母根。

準噶爾烏頭樣品于2010至2011年分別采自新疆伊犁地區尼勒克、新源、特克斯等不同產地，共6批。以上樣品經李永和主任中藥師鑒定均為毛茛科植物準噶爾烏頭Aconitum soongaricumStapf.的干燥塊根。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗 采用X Bridge C18色譜柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-水-三氯甲烷 (濃氨水調節pH為10.62)(70∶30∶2)為流動相，體積流量為1.0 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長為235 nm。理論板數按烏頭堿峰計算應不低于2 000。結果供試品及對照品色譜分離度良好，見圖1。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿對照品適量，置10 mL量瓶中，加二氯甲烷溶解并定容至刻度，搖勻，得烏頭堿質量濃度為0.201 2 mg/mL，新烏頭堿質量濃度為0.043 2 mg/mL，次烏頭堿質量濃度為0.041 9 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末 (粉碎后過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加10%氨試液4 mL，濕潤，精密加入乙醚20 mL，超聲處理 (功率300 W，頻率40 kHz;水溫在25℃以下)10 min，放冷，再稱定質量，用乙醚補足減失的質量，放置過夜，濾過，并用10 mL乙醚分3次洗滌藥渣，合并濾液，置50℃水浴揮干，殘渣用二氯甲烷溶解并轉移至5 mL量瓶中，加二氯甲烷至刻度，搖勻，取續濾液，即得。

2.4 線性關系的考察 分別精密吸取2.2項下對照品溶液各 0.5、5、10、20、30、40、50、60、70 μL，分別測定峰面積積分值。以烏頭堿對照品的進樣質量濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，進行線性回歸，得烏頭堿回歸方程y=363 962x+210 563，相關系數r=0.999 9。再分別精密吸取2.2項下對照品溶液各1、2、4、6、8、10、12 μL，分別測定峰面積積分值。分別以新烏頭堿、次烏頭堿對照品的進樣質量濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，進行線性回歸，得新烏頭堿回歸方程y=899 741x+305 2.5，相關系數r=0.999 9;得次烏頭堿回歸方程y=1 478 609.13x-30 112.29，相關系數r=0.999 9。表明，烏頭堿進樣質量濃度在0.100 6～14.084 0 mg/mL、新烏頭堿進樣質量濃度在0.043 2～0.518 4 mg/mL、次烏頭堿進樣質量濃度在0.041 9～0.502 8 mg/mL與峰面積呈良好的線性關系。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.5 精密度試驗 精密吸取2.2項下對照品溶液10 μL，連續進樣5次，按上述色譜條件進行測定，結果烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD分別為 0.71%、0.97%、1.02%，表明精密度較好。

2.6 穩定性試驗 按2.3項下方法制備供試品溶液 (2010年，尼勒克縣)，精密吸取，按上述色譜條件進行測定，每隔2 h進樣一次，共考察8 h，結果烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD分別為0.75%、0.82%、1.45%，表明供試品溶液穩定性較好。

2.7 重復性試驗 精密稱取本品6份 (2010年，尼勒克縣)，按2.3項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，結果烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的平均質量分數分別為8.531 1 mg/g，0.136 8 mg/g和 0.128 3 mg/g，RSD分別為1.25%，1.75%和1.70%。表明重復性較好。

2.8 加樣回收率試驗 取已知量準噶爾烏頭樣品(2010年，尼勒克縣)6份，每份約0.5 g，精密稱定，每份分別加入2.2項下對照品溶液各1 mL，按2.3項下方法制得供試品溶液。按上述色譜條件測定，計算回收率，結果見表1～3。表明本測定方法的回收率較好。

表1 烏頭堿加樣回收率測定結果Tab.1 Recovery results of aconitine

表2 新烏頭堿加樣回收率測定結果Tab.2 Recovery results of hypaconitine

表3 次烏頭堿加樣回收率測定結果Tab.3 Recovery results of mesaconitine

3 樣品的測定

分別取不同產地和批次的準噶爾烏頭和川烏樣品，按2.3項下方法制得供試品溶液，進樣10 μL，按上述色譜條件測定，測定結果見表4。

表4 測定結果 (n=3)Tab.4 Determination of contents(n=3)

4 討論

4.1 由于準噶爾烏頭與川烏為同屬植物［6］，所以本實驗測定準噶爾烏頭中雙酯型生物堿時先參照《中國藥典》2010年版一部川烏項下的HPLC方法進行［5］，結果圖譜分離效果不理想，對照品圖譜分離效果也較差。因此，參考文獻 ［7-10］對供試品前處理方法 (包括藥材粉碎粒度、藥材取樣量、提取溶劑、提取方法)和流動相 ［分別采用甲醇-水-乙腈 (67 ∶33 ∶2)、甲醇-水-三氯甲烷-氨水(70∶30∶2∶0.1)、甲醇-0.3%三乙胺-三氯甲烷(69∶30∶1)、乙腈-0.04 mol/L三乙胺 (pH3)(35∶65)、乙腈-四氫呋喃 (25∶15)A-0.1 mol/L乙酸銨溶液 (每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)B等不同流動相］進行了考察，又對初步確定的流動相的比例進行了調整，最終確定了峰形較好、分離度較好的色譜條件和供試品前處理方法。

4.2 目前關于準噶爾烏頭的研究報道很少，本實驗采用HPLC法可同時測定準噶爾烏頭中3種雙酯型生物堿 (烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿)，經方法學驗證表明該法簡便、可行。

4.3 根據6批不同產地、不同采集時期的準噶爾烏頭樣品測定結果表明，本品與已有法定藥材標準的川烏同樣含有雙酯型生物堿 (烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿)，其中烏頭堿的質量分數高于川烏藥材約24倍 (取不同產地的平均值)，新烏頭堿的質量分數約為川烏藥材的1/2，次烏頭堿質量分數約為川烏藥材的1/3，表明新疆準噶爾烏頭中烏頭堿質量分數較高，應具有抗炎鎮痛、對免疫系統影響等藥用價值［11-12］，但其與川烏所含的雙酯型生物堿各成分質量分數相差較大，其確切的藥理作用和毒性，以及與川烏藥材的親緣性仍有待進一步深入研究。

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