益氣化瘀化痰養陰方劑對肝纖維化大鼠TGF-β1表達的影響

李 艷， 曹文富

(重慶醫科大學中醫藥學院，重慶401331)

肝纖維化是肝臟遭到各種致病原侵襲時，肝臟細胞外基質分泌與降解失衡，從而在肝細胞間隙可逆性沉積的結果［1］。當前痰濁膠結加之氣虛血瘀促成肝纖維化是目前中醫醫學家對肝纖維化核心病機的共識。多年來，中醫治療肝纖維化取得了較好的臨床效果，但是如何以更科學手段和方法來揭示中醫治療效果，同時，反過來更有益指導中醫臨床治療成為當前重要科學問題。近年諸多文獻有采用突出益氣、化瘀、化痰、養陰等方法治療肝纖維化，以及突出幾種配伍方法結合治療肝纖維化的文獻報道，但是依然不能揭開這些方法治療的有效性能，對其效價不能進行單獨評價和衡量。益氣、化瘀、化痰、養陰四法單獨應用和合用到底有什么療效上的區別依然是困惑中西醫臨床的重要問題。許多文獻表明，TGF-β1是目前已知致肝纖維化最強的細胞因子，在形成肝纖維化的過程中起著至關重要的作用，以作為檢測肝纖維化的重要標志物［2-3］。因此，在本研究中分別采用益氣、化瘀、化痰、養陰單劑和合劑治療肝纖維化，通過檢測肝纖維化程度和TGF-β1作為中藥治療肝纖維化的療效指標，以期初步揭示益氣、化瘀、化痰、養陰四法單劑與合劑的治療效價，有益今后判斷用藥的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 雄性SD大鼠130只，清潔級，體質量180～220 g，由重慶醫科大學動物中心提供［許可證號 syxk(渝)20070001］。兔抗 TGF-β1(abcom)，RNA提取相關試劑 (天根公司)，TRPCR逆轉錄試劑盒 (東洋紡)，BCA試劑盒、蛋白裂解液 (碧云天公司)，山羊HRP標記二抗 (北京中杉)。

1.2 藥物 (1)精選中藥黃芪、白術，按1∶1比例配伍，混合水提并濃縮成益氣飲 (每1 mL含生藥2 g)。

(2)精選中藥川芎、姜黃，按1∶1比例配伍，混合水提并濃縮成化瘀飲 (每1 mL含生藥2 g)。

(3)精選中藥半夏、海藻，按1∶1比例配伍，混合水提并濃縮成化痰飲 (每1 mL含生藥2 g)。

(4)精選中藥鱉甲、白芍，按2∶1比例配伍，混合水提并濃縮成養陰飲 (每1 mL含生藥2 g)。

(5)精選中藥黃芪、白術、川芎、姜黃、半夏、海藻、白芍、鱉甲，按1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶2比例配伍，混合水提并濃縮成益氣化瘀化痰養陰的合劑 (每1 mL含生藥2 g)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 130只雄性SD大鼠，隨機分為正常對照組10只、肝纖維化模型組20只、益氣組20只、化瘀組20只、化痰組20只、養陰組20只、合劑組20只。

1.3.2 造模方法 除正常對照組大鼠給予正常普通飼料喂養外，其余各組大鼠:(1)給予39.5%玉米面+40%面粉+20%豬油+0.5%膽固醇組成的高脂低蛋白飼料;(2)采用背部皮下注射40%CCl4油劑，每周2次，共計12周。第一周的2次皮下注射劑量皆為0.5 mL/100 g體質量，以后每次注射劑量為0.3 mL/100g體質量，安排每周星期2和星期5進行。建立肝纖維化大鼠模型，并將試驗大鼠隨機分入相應各組;(3)每天5%酒精作為唯一飲料。造模12周后，死亡率為55%左右，即除正常對照組大鼠無死亡外，其它6組實驗組，每組平均剩9只SD肝纖維化大鼠，只對益氣組、化瘀組、養陰組、化痰組、合劑組此5組用藥。中藥的用量，黃芪、白術、川芎、姜黃、半夏、海藻、白芍皆為6 468 g，鱉甲12 936 g。

1.3.3 給藥方法 (1)益氣組、化瘀組、化痰組、養陰組、合劑組，各組剩下的9只實驗大鼠用相對應的中藥飲劑——益氣飲、化瘀飲、化痰飲、養陰飲及合劑灌胃;每只大鼠按約3 mL/(100 g·d)劑量灌胃;(2)肝纖維化模型組:9只大鼠生理鹽水灌胃 (劑量約3 mL/(100 g·d);(3)正常對照組:10只大鼠生理鹽水灌胃 (劑量約3 mL/(100 g·d)。連續14周。

1.3.4 標本留取 最后一次用藥后24 h，免疫組化標本采用心臟灌注方法取標本，電鏡和分子生物學標本采用麻醉大鼠，斷頭處死大鼠取肝臟，取部分肝組織用10%中性福爾馬林溶液或戊二醛-鋨酸雙重固定，待做免疫組化或電鏡檢查，其余標本于液氮中冷凍后再轉移到-70℃冰箱中保存。

1.4 觀察指標

1.4.1 電鏡觀察 電鏡顯示各實驗組肝臟的超微結構變化、膠原纖維的沉積情況等。見圖1.

1.4.2 Masson三色膠原染色 對肝組織石蠟切片進行Masson法常規纖維染色，光鏡觀察肝纖維化程度等。

1.4.3 RT-PCR法檢測肝組織TGF-β1 mRNA表達提取大鼠肝組織總RNA，然后在42℃20 min條件下逆轉錄為 cDNA。于 genebank中查的大鼠TGF-β1和GAPDH整個核酸序列，利用Premier5.0查得其引物詳見下列，退火溫度56℃。PCR反應條件預變性94℃ 4 min，變性94℃，30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，共30個循環，最后72℃延伸5 min。反應結束后取PCR產物再濃度為1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳。在紫外燈光下觀察電泳結果，并用凝膠在Bio-Rad公司所生產的凝膠成像儀上用Quantityone圖像分析軟件進行照相分析。各條帶的相對光密度值=目的條帶光密度值/內參GAPDH條帶光密度值。

GAPDH:上游:GTGGAGTCTACTGGCGTCTT;下游:GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT，擴增275 bp

TGF-β1: 上 游:CATGGAGCTGGTGAAACG;下游:TGAAGCGAAAGCCCTGTA，擴增548 bp

1.4.4 Western blot法檢測肝組織TGF-β1蛋白表達 肝臟組織，加入10倍體積的組織裂解液勻漿，冰浴30 min后，4℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清，BCA試劑盒蛋白定量，組織總蛋白加入上樣緩沖液煮沸變性。30 g蛋白經15%SDS-PAGE膠分離后轉移到PVDF膜，3%BSA室溫封閉2 h，加入一抗4℃過夜，TBS-T洗膜后加HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，加入ECL發光液，經EC檢測系統檢測各組TGF-β1蛋白表達。

1.5 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件包進行數據處理，計量資料采用用方差分析和LSD檢驗，以P＜0.05確定差異有統計學意義。

圖1 各組大鼠益氣化瘀化痰養陰單劑與合劑對肝纖維化大鼠肝組織電鏡影響變化Fig.1 Effects of electron microscope on rats of hepatic fibrosis by single prescriptions and mixture of benefiting“qi”，removing blood stasis，reducing phlegm and nourishing“yin”

2 結果

2.1 電鏡結果 正常對照組大鼠肝組織切片電鏡顯示，肝組織一切正常，其周圍無明顯膠原纖維沉積 (見圖1a)。肝纖維化模型組可見膽小管擴張(見圖1b)，肝組織大量膠原纖維沉積 (見圖1c)。益氣組可見內皮細胞腫脹、見髓樣變，少量膠原纖維沉積 (見圖1d)?；鼋M可見血竇內微絨毛輕微腫脹和變性 (見圖1e)，膽小管改變不明顯，極輕微擴張，少量細胞見脂滴 (見圖1f)?；到M可見肝細胞腫脹，有部分溶解，肝細胞間隙增大，膽小管擴張，內見髓樣變 (見圖1g)。養陰組可見毛細血管內皮細胞腫脹、溶解，膽小管未見擴張，胞漿有很輕微的溶解 (見圖1h)。合劑組可見正常肝細胞，血竇內微絨毛改變不明顯 (見圖1i)。

2.2 Masson三色膠原染色結果 正常對照組大鼠肝組織切片顯示，肝組織一切正常，其周圍無明顯膠原纖維沉積 (見圖2a)。肝纖維化模型組可見肝組織內大量膠原纖維沉積 (見圖2b、2c)。益氣組(見圖2d)、化痰組 (見圖2e)、化瘀組 (見圖2f)、養陰組 (見圖2g)皆可見肝內膠原纖維組織中度增生。合劑組肝內膠原纖維組織增生不明顯(見圖2h)。

圖2 益氣化瘀化痰養陰單劑與合劑對肝纖維化大鼠肝組織的Masson三色膠原染色 (×400)Fig.2 The VG staining in the rats of hepatic fibrosis by single presctiptions and mixture of benefiting“qi”，removing blood stasis，reducing phlegm and nourishing“yin”(×400)

2.3 RT-PCR檢測TGF-β1 mRNA的表達 與肝纖維化模型組相比，益氣組、化瘀組、化痰組、養陰組中大鼠肝組織 TGF-β1基因表達降低 (P＜0.01)，其中養陰組與化瘀組、益氣組、化痰組相比，大鼠肝組織TGF-β1基因表達相對明顯降低(P＜0.05)。與益氣組、化瘀組、化痰組、養陰組相比，合劑組中大鼠肝組織TGF-β1基因表達明顯降低 (P＜0.05)見圖3，表1。

圖3 益氣化瘀化痰養陰單劑與合劑對肝纖維化大鼠TGF-β1mRNA的表達影響Fig.3 Effects of TGF-β1 TGF-β1mRNA expression on rats of hepatic fibrosis by single prescriptions and mixture of benefiting“qi”，removing blood stasis，reducing phlegm and nourishing“yin”

2.4 Western Blot法檢測肝組織TGF-β1蛋白表達 與肝纖維化模型組相比，益氣組、化瘀組、化痰組、養陰組中大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達降低(P＜0.01)，其中養陰組與化瘀組、益氣組、化痰組相比，大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達相對明顯降低 (P＜0.05);與益氣組、化瘀組、化痰組、養陰組相比，合劑組中大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達明顯降低 (P＜0.05)見圖4。

圖4 益氣化瘀化痰養陰單劑與合劑對肝纖維化大鼠TGF-β1蛋白的表達影響Fig.4 Effects of TGF-β1 TGF-β1 protein expression on rats of hepatic fibrosis by single prescriptions and mixture of benefiting“qi”，removing blood stasis，reducing phlegm and nourishing“yin”

3 討論

肝纖維化是由各種致病因子所致肝內結締組織異常增生，導致肝內彌漫性細胞外基質過度沉淀的病理過程，作為一種慢性、進行性、彌漫性的肝臟病變，治療不及時或治療不當都可使其發展為肝硬化。許多文獻表明，TGF-β1是目前已知致肝纖維化最強的細胞因子，在形成肝纖維化的過程中起著至關重要的作用［2］。在血液中，TGF-β1作為一種失活的蛋白能夠被多種因素激活［4-5］。激活的TGF-β1具有內分泌和旁分泌的作用，通過結合肝細胞表面的TGF-β1受體，來激活MAPK和Smad信號通路促使肝星狀細胞活化［6］，從而導致過量細胞外基質的沉積［7］，最終導致肝纖維化。前述說明TGF-β1在肝纖維形成過程中起著重要的作用，可以用來作為肝纖維化的重要參考指標。

本實驗結果顯示，益氣、化瘀、化痰、養陰單劑均能夠降低肝纖維化模型組肝組織內纖維化程度，但是它們之間卻有降低程序的差異。在單獨的四種方法治療中，養陰法治療效果最好，益氣法治療效果最差，化瘀法與化痰法之間差異不大，說明化瘀與化痰在治療上均達到同等的效果。四種單獨治療方法的比較，使今后在用藥文獻更趨于重養陰之法。研究發現，與單劑相比，共用益氣化瘀化痰養陰四法更能夠有效降低肝組織內纖維化程度，說明單獨治療雖然不能完全達到最好的療效，但是它們在共同配伍之中卻起到更好的治療作用。

肝纖維化屬于近代醫學提出的西醫診斷名稱，中醫學領域根據臨床癥候特點，可歸屬于中醫“脅痛”、“積聚”、“痰凝”、“黃疸”等病范疇，而中醫治療突出整體觀念和辨證論治，所以治療方法也多異，無完全統一的治療模式和方法。其總體病機既可歸結于氣虛使津液不能正化，故凝而為痰;又可為外感六淫、內傷七情、飲食失當等多種致病因素致氣機阻滯而致病;另外正如《血證論》中所云“血不利則為水，水凝而成痰”，“血積既久，亦能化為痰水”，“久病血運不利”，最終形成肝纖維化病機的中心環節是痰濁膠結加之氣虛血瘀促成。痰阻則氣血不利，而致血滯血瘀，加之痰濁與瘀血互為因果，互相轉化，相互膠結，臟腑氣血功能日益虛損和失調，而致頑癥重癥，病情纏綿難愈。近些年來，采用益氣活血、化瘀化痰、養陰軟堅等均可以有效延緩或抑制治療肝纖維化進程，取得了較好的療效。養陰藥中鱉甲味咸，性微寒，歸肝、腎經，具有滋陰潛陽、軟堅散結、退熱除蒸等功效。鱉甲含骨膠原、碳酸鈣、磷酸鈣、中華鱉多糖和17種氨基酸，還含有十多種微量元素，可提高機體免疫力，其所含的大量氨基酸具有抑制肝臟纖維增生、促進肝內新生纖維吸收的作用，成為治療肝纖維化應用最廣的藥物之一［8］。白芍是我國傳統中藥，具有養血柔肝、緩中止痛、斂陰收汗之功效。白芍總苷是白芍根中提取的有效部位，具有明顯的抗炎、免疫調節和抗氧化等作用，能夠降低肝纖維化大鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶，天冬氨酸氨基轉移酶，透明質酸以及PCⅢ膠原的水平，抑制肝星狀細胞的功能及促進其凋亡等，從而對肝纖維化大鼠具有良好的防治作用［9］。另外有研究表明，姜黃、黃芪、川芎等藥物可以顯著抑制實驗性肝纖維化大鼠模型的肝纖維化，其機制可能與抑制TGF-β1的表達有關［10］;復方黃芪顆?？梢栽诘鞍姿皆鰪奙MP-2酶蛋白的表達，同時抑制TIMP-2酶蛋白的表達，促進ECM的降解，從而達到逆轉肝纖維化的目的［11］。本實驗通過益氣化瘀化痰養陰法單劑和合劑，通過抑制TGF-β1產生和表達，從而抑制細胞外基質形成和促進細胞外基質的降解，改善肝組織器官代謝狀況等途徑，從而抑制與延緩肝纖維化的進程，控制肝纖維化這類難治性疾病的進展［12］。

總之，本研究提示益氣、化瘀、化痰、養陰四法單劑治療都可以降低肝組織內纖維化程度，但也有程度差異;四劑合用更能夠明顯降低肝組織內纖維化程度，說明益氣化瘀化痰養陰法對肝纖維化能達到更好的療效，這種治療特點可以有效指導臨床，對于深入闡釋中醫藥益氣化瘀化痰養陰法治療肝纖維化的機制，不斷提高中醫藥防治肝纖維化的水平，促進學科進步具有重要意義。

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