賴諾普利對大鼠膽汁淤積性肝硬化的抗肝纖維化作用

吳紅專，朱燦陽，劉俊

(海南省人民醫院藥學部，海南海口570311）

·實驗研究·

賴諾普利對大鼠膽汁淤積性肝硬化的抗肝纖維化作用

吳紅專，朱燦陽，劉俊

(海南省人民醫院藥學部，海南海口570311）

目的探討賴諾普利對膽汁淤積性肝硬化的抗肝纖維化作用。方法采用膽總管結扎術制備大鼠膽汁淤積性肝硬化模型，分為賴諾普利組和模型對照組。前者于術后第3周給藥，具體為：賴諾普利0.1 mg/kg灌胃，1次/d，連續4周；后者于術后第3周給予生理鹽水10 ml/kg灌胃，1次/d，連續4周。同期設假手術組作為空白對照。6周后處死大鼠，取三組實驗大鼠肝組織進行常規病理染色和膠原纖維染色；用放射免疫法測定各組血清透明質酸酶(HA)和層粘連蛋白(LN)含量，并測定肝組織羥脯氨酸(HYP）含量。結果與空白對照組比較，賴諾普利組和模型對照組的血清HA、LN活性均下降，而肝組織HYP含量均升高，差異均有統計學意義(P＜0.05)。與模型對照組比較，賴諾普利組肝細胞損傷和肝纖維化程度較輕。賴諾普利組的血清HA、LN活性以及肝組織HYP含量分別為(62.1±2.23)ng/ml、(42.8±6.23)ng/ml和(1.6±0.15)μg/mg，明顯低于模型對照組的(97.5±4.50)ng/ml、(66.5±7.32）ng/ml和(2.0±0.27）μg/mg(P＜0.05）。結論賴諾普利可以有效改善膽汁淤積性肝硬化大鼠模型的肝纖維化程度。

肝硬化；膽汁淤積；肝纖維化；賴諾普利

肝纖維化是慢性肝病重要的病理特征，也是慢性肝炎發展至肝硬化的必經階段，但迄今為止，尚缺乏能夠有效治療肝纖維化的藥物。目前認為，肝纖維化的發生機制主要是肝星狀細胞的活化以及細胞外基質的合成與降解失衡導致其在細胞間質過度沉積所致。有研究表明，血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)與緊張素Ⅱ(AT-Ⅱ)受體阻斷劑均可以抑制肝纖維化[1-2]，但相關的研究報道較少。本研究于2011年5～10月建立膽汁淤積性肝硬化動物實驗模型，旨在探討ACEI藥物賴諾普利在膽汁淤積性肝硬化大鼠模型中的抗肝纖維化作用。

1 材料與方法

1.1 動物14周齡Wistar大鼠30只，雌雄不分，體重(202±18)g，由海南省藥品檢驗所實驗動物中心提供。

1.2 藥品與試劑賴諾普利10 mg/片，為捷利康有限公司產品；層粘蛋白(LN)放射兔疫分析測定盒、透明質酸(HA)放射免疫分析測定盒均為北京科美東雅生物技術有限公司產品；羥脯氨酸(HYP)為南京建成生物工程研究所產品。

1.3 實驗分組參照文獻[3]將30只SD大鼠隨機分為三組：空白對照組、模型對照組和賴諾普利組，各10只。模型對照組及賴諾普利組均實施膽總管結扎術，具體為：固定SD大鼠，用戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，正中切口進腹，暴露膽總管，用絲線結扎橫斷膽總管，關腹。空白對照組開腹后僅游離膽總管不予結扎，關腹。三組SD大鼠術后1～3 d肌注青霉素，2次/d，2.5 WU/次。術后第3周模型對照組和賴諾普利組分別開始給藥，模型對照組：生理鹽水10 ml/kg灌胃，1次/d，連續4周；賴諾普利組：賴諾普利0.1 mg/kg灌胃，1次/d，連續4周。

1.4 檢測指標及評價末次給藥24 h取SD大鼠血清4 ml檢測HA和LN含量。處死SD大鼠后在右肝最厚處切取1.0 cm×0.8 cm左右的肝組織2塊，1塊按照常規病理制作石蠟切片，切片厚4 μm，采用常規病理染色(HE)及膠原纖維染色(Masson)觀察；另1塊制成肝組織勻漿檢測HYP含量。光鏡下觀察大鼠肝組織的肝纖維化程度及肝組織炎癥活動度參照文獻[4]制定的肝纖維化程度分級標準：(－)為匯管區纖維組織無增生，(+)為增生后面積＜肝小葉1/3，(++)為增生后面積占肝小葉1/3～2/3，(+++)為增生后面積＞肝小葉2/3。

1.5 統計學分析應用SPSS17.0軟件對數據進行處理，計量資料以均數±標準差表示，用單因素方差或秩和檢驗，肝纖維化程度分級數據用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組SD大鼠的大體情況空白對照組大鼠發育良好，毛發有光澤，無尾黃、耳黃、毛發黃、小便發黃等；模型對照組精神差，活動少，出現尾部黃染、耳黃、毛發黃染等表現；賴諾普利組健康狀態相對較好，毛色較好，尾部黃染、耳黃、毛發黃染等不明顯。

2.2 三組SD大鼠的肝組織病理學檢查大體觀察：與空白對照組比較，模型對照組的肝臟表面呈黃綠色，表面呈桔皮樣，部分表面呈顆粒狀，邊緣變鈍，質脆；賴諾普利組的肝臟顏色較紅潤，呈花斑狀，柔軟，表面顆粒較少，未見明顯結節。光鏡觀察：空白對照組的肝臟小葉結構清晰，肝細胞索由中央靜脈呈放射狀向四周排列，肝竇正常，肝竇內及匯管區周圍有少量間質細胞；模型對照組的肝組織結構破壞嚴重，肝細胞呈花環狀，多數有管腔，可見大量膠原組織沉積，纖維化增生明顯；賴諾普利組的膽管上皮細胞增生匯管區面積擴大，增生的膽管上皮細胞周圍有纖維組織增生，可見肝細胞部分壞死及炎性細胞浸潤。按照肝纖維化程度分級標準，賴諾普利組中4只大鼠肝纖維化(+)，6只肝纖維化(++)，無肝纖維化(+++)，肝纖維化程度明顯低于模型對照組，見表1。

表1 三組大鼠肝臟的纖維化程度分級情況（只）

2.3 三組SD大鼠肝組織HYP的比較空白對照組、模型對照組和賴諾普利組的大鼠肝臟HYP分別為(0.8±0.12)μg/mg、(2.0±0.27)μg/mg和(1.6± 0.15)μg/mg；與空白對照組比較，模型對照組和賴諾普利組HYP含量均顯著升高(P＜0.05)；與模型對照組比較，賴諾普利組的HYP含量明顯降低(P＜0.05)。

2.4 三組SD大鼠血清HA、LN的比較與空白對照組比較，模型對照組和賴諾普利組大鼠血清HA、LN含量均顯著升高(P＜0.05)；與模型對照組比較，賴諾普利組的HA、LN含量明顯降低(P＜0.05)，見表2。

表1 三組SD大鼠血清HA、LN的比較（ng/ml）

3 討論

肝纖維化是慢性肝損傷向肝硬化發展的重要環節和必經階段，貫穿于肝硬化發展的整個過程，然而目前針對肝纖維化本身治療的有效藥物較少，因此積極尋找抗肝纖維化藥物迫在眉睫。從生物化學角度來看，肝纖維化與肝臟細胞外基質的合成增加密切相關，因此目前常常通過檢測血清中細胞外基質成分及其代謝產物來判斷肝纖維化，包括HA、LN、Ⅲ型前膠原氨基端肽(PCⅢNP)和Ⅳ型膠原(C-Ⅳ)[5-7]。HYP是膠原蛋白中特有的代謝產物，其在肝臟組織中的含量可以用來衡量肝纖維化的程度[8-9]。賴諾普利是繼卡托普利、依那普利之后第3代含羧基活性型ACEI，能有效抑制AT-Ⅱ生成，可以作為抗肝纖維化的藥物[2]。Wolf等[10]報道ACEI與AT-Ⅱ受體阻斷劑抑制肝纖維化的機制包括兩個方面：一方面抑制AT-Ⅱ對肝星狀細胞活化后直接促增殖及促細胞外基質分泌效應，另一方面可以消除AT-Ⅱ對間質纖維母細胞TGF-β自分泌的正向調節作用，從而抑制細胞外基質的合成。

為探討賴諾普利在肝纖維化中的作用，本實驗構建了膽汁淤積性肝纖維化模型。既往文獻報道[11-12]，采取膽總管結扎大鼠模型在2～6周能夠有效建立膽汁淤積性肝纖維化模型，因此本組實驗采用兩周后給藥，直至6周結束時通過病理和血清放射免疫法檢測分析賴諾普利對膽管結扎誘發大鼠淤膽性肝纖維化的干預效果。結果顯示，與模型對照組比較，賴諾普利組大鼠的健康狀態相對較好，全身黃染不明顯，肝組織中膽管上皮細胞有增生，周圍伴有纖維組織增生，肝細胞呈部分壞死及炎性細胞浸潤；血清放射免疫法檢測HA、LN的活性均有明顯的下降，肝組織HYP含量亦明顯減少。上述結果提示賴諾普利可降解淤膽性肝纖維化大鼠細胞外基質的合成，膠原沉積減少，明顯降低肝纖維化的程度。

綜上所述，賴諾普利能夠延緩肝纖維化的進展以及減輕肝組織的損傷，對大鼠淤膽性肝硬化的肝纖維化有良好的治療作用，其具體的分子生物學機制尚需進一步探討。

[1]Huang ML,Li X,Meng Y,et al.Upregulation of angiotensin-converting enzyme(ACE)2 in hepatic fibrosis by ACE inhibitors[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol,2010,37(1)：1-6.

[2]劉紅艷,王艷.肝纖維化的藥物治療作用機制研究進展[J].中國藥物與臨床,2010,10(5)：596-598.

[3]孫楊忠,耿小平.阻塞性黃疸大鼠膽總管直徑、壓力及血清膽紅素代謝變化的觀察[J].肝膽外科雜志,2003,11(2)：141-143.

[4]安德明,季光,鄭培永.PAI-1在大鼠膽汁淤積性肝纖維化形成中的動態變化[J].世界華人消化雜志,2008,16(3)：246-252.

[5]趙雪梅,曹學征.Ⅳ型膠原蛋白和層黏蛋白及透明質酸對肝纖維化的診斷價值[J].實用醫技雜志,2006,13(17)：3013.

[6]韋仕高.肝纖維化與血清學指標的相關性[J].海南醫學,2009,20 (7)：288-290.

[7]李忻,劉玲,李加新.肝炎患者血清肝纖維化指標及PAPP指數檢測在肝纖維化診斷中的價值[J].海南醫學,2009,20(10)：16-18.

[8]黃鳳嬌,李筠,趙艷玲,等.復方黃芪顆粒對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的保護作用[J].中國實驗方劑學雜志,2006,12(3)：37.

[9]楊宏生,李旭東,王奕忠,等.聯合檢測血清層粘蛋白、透明質酸及脯氨酸肽酶對肝硬化早期的評估[J].海南醫學,2003,14(3)：49-50.

[10]Wolf G,Ziyadeh FN,Stahl RA.AngiotensinⅡstimulations expression of transforming growth factor beta receptor typeⅡin cultured mouse proximal tubular cells[J].Mol Med,1999,77(7)：556-564.

[11]胡秀萍,吳櫻櫻,朱虹,等.肝靈對大鼠膽汁淤積性肝硬化的抗肝纖維化作用[J].安徽醫科大學學報,2005,40(4)：316-318.

[12]董玉芳,文陽安,周倩云,等.膽總管結扎對小鼠肝臟炎癥和細胞凋亡的影響[J].重慶醫科大學學報,2009,34(12)：1632-1636.

Inhibitory effects of lisinopril on obstructive cholestasis induced liver fibrosis in mice.

WU Hong-zhuan,ZHU Chan-yang,LIU Jun.Department of Pharmacy,Peolple's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311，Hainan，CHINA

ObjectiveTo study the effect of lisinopril on bile duct ligation-induced biliary cholestasis on liver of mice.MethodsThe experimental model mice of hepatic fibrosis was induced by common bile duct ligation,which were divided into model control group and lisinopril group.Three weeks after the operation,lisinopril(0.1 mg/kg)and physiological saline(10 ml/kg)were administrated respectively by intragastric in lisinopril group and model control group,with once a day for 4 consecutive weeks.False operation group was as blank control in the same period.All the mice were sacrificed six weeks later.Liver tissues of the three groups were detected by routine histological staining and collagen fiber staining;serum hyaluronate lyase(HA)and laminin(LN)levels were measured by radioimmunoassay,including liver hydroxyproline(HYP)content.ResultsSerum HA and LN contents in model control group and lisinopril group were decresed and liver HYP content were increased compared with those in blank control group (P＜0.05).Liver cells injury and the degree of liver fibrosis in lisinopril group were lighter compared with those in model group.Serum HA,LN contents and liver HYP content in lisinopril group were(62.1±2.23)ng/ml,(42.8±6.23)ng/ml and(1.6±0.150)μg/mg,significantly lower than those in model group[（97.5±4.50）ng/ml,(66.5±7.32)ng/ml and(2.0± 0.27)μg/mg;all theP＜0.05].ConclusionLisinopril has effect on preventing hepatic fibrosis in mice model with bile duct ligation-induced biliary cholestasis.

Cirrhosis;Cholestasis;Liver fibrosis;Lisinopril

R-332

A

1003—6350(2012）18—015—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.18.006

2012-04-01)

吳紅專（1973—），女，海南省海口市人，主管藥師，本科。E-mail：whz04111@126.com