miR-21、miR-155在乳腺癌患者血液與腫瘤組織中表達水平的相關性研究

卞國奉，陳愛軍

(1.三峽大學第一臨床學院，湖北宜昌443003；2.宜昌市中心人民醫院普外三科，湖北宜昌443003)

miR-21、miR-155在乳腺癌患者血液與腫瘤組織中表達水平的相關性研究

卞國奉1，陳愛軍2*

(1.三峽大學第一臨床學院，湖北宜昌443003；2.宜昌市中心人民醫院普外三科，湖北宜昌443003)

目的對健康女性血清及乳腺癌患者血清中miR-21和miR-155表達水平進行實時定量PCR檢測，同腫瘤患者癌組織與對應癌旁組織的miR-21和miR-155表達水平的變化趨勢相比較，以評價血清中miR-21和miR-155在乳腺癌早期診斷中的潛在價值。方法收集健康女性血液和患者血液與患者癌組織和癌旁組織，利用實時熒光定量PCR對提取的RNAmiR-21和miR-155進行相對定量檢測，得到miR-21和miR-155在血清中變化趨勢與在組織中變化趨勢的相關性。結果miR-21和miR-155在腫瘤組織的表達水平明顯高于其在癌旁組織的表達水平，miR-21和miR-155在乳腺癌患者血清中的表達水平也要高于其在健康體檢者血清中的表達水平。血清中miR-21和miR-155表達水平變化趨勢與組織中miR-21和miR-155表達水平變化趨勢一致。結論血清中miR-21和miR-155能反映乳腺癌的發生，miR-21和miR-155有可能作為乳腺癌早期診斷的腫瘤標志物。

MicroRNA；乳腺癌；腫瘤標記物；miR-21；miR-155

MicroRNA(又叫miRNA或微RNA)是一類內源性非編碼的小RNA，廣泛存在于動物、植物和病毒中，通過與目標mRNA的3'UTR序列互補配對，調控靶基因的表達或翻譯，參與生物體的發育、炎癥、腫瘤等多種生理、病理過程[1-3]。最近發現MicroRNA常常在癌癥中異常表達，一些MicroRNA在癌癥中上調，而另一些則下調。MicroRNA在乳腺癌中表達譜的研究提示了可能作為一種新的疾病診斷，分類和預后判斷的工具，越來越多的證據表明MicroRNA的分析可以用于惡性腫瘤的診斷、預后判斷和治療[4-6]。

俄亥俄大學Croce的實驗室已經發現了5種MicroRNA是成功鑒別正常組織與腫瘤組織所必需的，本實驗以癌組織比癌旁組織表達量升高的miR-21、miR-155為代表[3]，以U6作為參照物分析患者血清、健康女性血清中miRNA的變化趨勢和癌組織、癌旁組織miRNA變化趨勢的相關性，得到血清miRNA作為腫瘤標志物早期診斷乳腺癌的可能性。

1 資料與方法

1.1 實驗材料41例乳腺癌患者腫瘤組織及相應癌旁組織(距腫瘤邊緣≤3 cm)、術前外周血各一份。并收集健康女性體檢者外周血41份，保存至超低溫冰箱中。所有患者取血之前均未進行手術、化療、放療或內分泌治療。不限制患者的年齡、腫瘤分級和分期，但既往有腫瘤病史和其他部位轉移的乳腺腫瘤排除在外。正常對照者為同一時期進行年度體檢的正常人群，入選標準是無腫瘤病史和臨床體征的女性健康體檢者。所有標本均來自宜昌市中心人民醫院。

1.2 實驗試劑TRIzol購于Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒購于Fermentas；RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司(DP433)；SYBR熒光定量PCR檢測試劑盒購于Fermentas；引物合成由南京金斯瑞生物科技有線公司完成；實時熒光定量PCR儀Illumine eco；離心機購于Eppendorf。

1.3 相關引物miR-21：loop primer5'-GTCGT ATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGA TACGACTCAAC-3'，上游引物：5'-TGCGCTAGCTTA TCAGACTGAT-3'，下游引物：5'-CCAGTGCAGGGT CCGAGGTATT-3'；miR-155：loop primer5'-GTCGTA TCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACGGGGT-3'，上游引物：5'-TGCGCTAATGCT AATCGTGATA-3'，下游引物：5'-CCAGTGCAGGGTC CGAGGTATT-3'；U6上游引物：5'-CGCTTCGGCAG ACATATAC-3'，下游引物：5'-AAATATGGAACGCTT CACGA-3'。

1.4 實驗步驟

1.4.1 TRIzol法提取RNA嚴格按試劑說明書操作。所有標本經紫外分光光度檢測OD260/OD280比值為1.8～2.0方可進行后續操作。

1.4.2 逆轉錄按如下成分配置反應體系：TotalRNA、miRNA-loop primer(內參基因加Oligo dT)、dNTP，并用水補不足。70℃5 min，短暫離心后置于冰上急冷。然后在管中加入5×RT buffer、HRP(RRI)/ RNase Inhibitor、M-MLV、ddH2O(Rnase free)，置于儀器上42℃60 min，95℃5 min。

1.4.3 PCR擴增按如下成分配置反應體系：miRNA上游引物，下游引物，dDNTP，ExTaq，10×ExTaqE buffer，cDNA，ddH2O。反應條件94℃4 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃25s；72℃4 min，4℃4 min，35個循環。

1.4.4 實時熒光定量PCR按如下成分配置反應體系：cDNA，上游引物，下游引物，SYBR Green/ Flourescein qPCR Master Mix，ddH2O，反應條件：Cycle 1：(1×)50.0℃2 min，95.0℃10 min，Cycle 2：(40×)95.0℃30 s，60.0℃30 s。

1.5 統計學分析記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的域值時所經歷的循環數(Ct)，采用定量PCR中的相對定量法，用檢測到的Ct值，以U6 ncRNA的量為內參照，以癌旁組織和健康女性血清為對照，計算miR-21//155的相對量，計算公式：F＝2－△△Ct，△△Ct＝(CtmiR-21/155-CtU6 ncRNA)腫瘤/血清-(CtmiR-21/155-CtU6 ncRNA)對照，F代表miR-21/155在腫瘤組織或血清的表達相對于配對癌旁組織或健康女性血清的差異表達倍數。配對設計資料用Wilcoxon符號秩檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 紫外分光光度計檢測各標本總RNA吸光度比值總RNA提取之后，將其加入DEPC水中(稀釋100倍)，測260 nm、280 nm吸收值，計算OD260/280比值和濃度(μg/ml)，本實驗總RNA溶液OD260/280比值波動于1.8～2.0，說明提得的總RNA純度較高，符合后續試驗的要求。

2.2 miRNA擴增曲線miR-21、miR-155、U6 ncRNA的擴增曲線見圖1，分為三個階段：熒光背景信號階段、指數擴增階段、平臺期。其形狀是一條平滑的S型曲線。

2.3 miRNA溶解曲線miR-21、miR-155、U6 ncRNA擴增產物顯示單一溶解峰，見圖2，說明引物設計合理，無非特異性擴增，符合實驗要求。

2.4 標本實時定量PCR結果經公式計算miR-21/155的相對表達量，患者血清中miR-21相對表達量為健康女性的2.387倍，血清中miR-155相對表達量則為2.274倍。患者腫瘤組織中miR-21相對表達量為癌旁組織的1.638倍，組織中miR-155相對表達量則為2.137倍。以上分析結果提示在乳腺癌患者血清miRNA的變化趨勢與組織中的一致。采用配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗，P＜0.05，差異有統計學意義。說明這兩個指標的變化均能提示乳腺癌的發生，miR-21/155有成為乳腺癌腫瘤標記物的可能，可以用于乳腺癌的早期診斷。

圖1 U6 ncRNA、Hsa-miR-155、Hsa-miR-21擴增曲線

圖2 U6 ncRNA、Hsa-miR-155、Hsa-miR-21溶解曲線

3 討論

近年來的研究結果表明，miR-21和miR-155在乳腺癌的發生發展中可能起到了關鍵作用，Iorio等[7]采用微陣列和Northern印跡方法發現，miR-155和miR-21在乳腺癌組織中高表達幾倍到幾十倍。但它們引起乳腺癌發生發展的具體機制鮮被報道。

實時熒光定量PCR(Realtime RT-PCR)是在定性PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術，于1996年由美國Applied biosystems公司推出。相對于普通的PCR，操作時受污染的機會少、自動化程度高、功能強大、省時、特異性和靈敏度也較高。成熟的MicroRNA長平均長度為22 nt，同類的MicroRNA甚至只有一兩個堿基的差別，且提取出來的RNA易受外界污染，這些特點給傳統的Northern blot、Microarray、RT-PCR等常規檢測手段帶來了極大的困難和挑戰，其結果特異性也不強[8]。本實驗采用Realtime RT-PCR檢測組織與血液里miR-21和miR-155的表達，通過檢測吸光度表達，溶解曲線單峰及對照結果，可以看出采用莖環RT逆轉錄引物的Realtime RT-PCR技術對乳腺癌相關MicroRNA的檢測靈敏性較高，檢測結果可信度高。腫瘤的發生發展及轉移都伴隨著miRNA表達譜的變化[9]。大多數情況下，腫瘤組織中的miRNA表達水平比正常組織低，也有部分miRNA在腫瘤組織中的表達水平升高。本實驗選取的兩個miRNA在腫瘤樣品中都與血液樣品中表達水平均上調，與腫瘤的發生有正向調節作用。因為MicroRNA在組織及血液中表達量甚微，實驗選取的兩個指標上調，相對于負向調節作用的MicroRNA，更容易被檢測到，為miR-21和miR-155成為乳腺癌腫瘤標記物提供了幫助。

實時定量PCR實驗設計和數據分析可以采用相對定量和絕對定量兩種方法，如果需要知道絕對的拷貝數，就必須用絕對定量的方法，否則只需要給出基因表達相對量就足夠了。相對定量可能比絕對定量要更容易一些，因為它不需要作標準曲線。本實驗采用相對定量法，通過2－△△Ct法分析相對基因表達差異更簡單方便。

本實驗中乳腺癌患者腫瘤組織中miR-21和miR-155的相對表達量明顯大于癌旁正常組織的表達，患者血清中的miR-21和miR-155的相對表達量亦明顯大于健康女性血清中的表達，組織與血清中的miR-21和miR-155變化趨勢相一致，提示miR-21和miR-155這兩個指標有成為乳腺癌腫瘤標記物的可能，可用于乳腺癌的早期診斷。這種方法也可以推廣到其他腫瘤中去，找出各個腫瘤中特異性較高的MicroRNA，在更多實驗基礎上證明MicroRNA是一種可靠的生物標記，且能被簡單準確地檢測出來。如此，將會在極大程度上促進腫瘤的早期診斷的發展，為患者贏得寶貴的時間。

[1]He H,Jazdzewski K,Li W,et al．The role of microRNA genesin papillary thyroid carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102 (52)：19075-19080.

[2]Chan JA,Krichevsky AM,Kosik KS.MicroRNA-21 is an antipoptotic factor in human glioblastoma cells[J].Cancer Res,2005,65 (14)：6029-6033.

[3]Szafranska AE,Davision TS,John J,et al.MicroRNAexpression alterations are linked to tumorigenesis and non-neuplastic processs in pancreatic ductal adenocarcino[J].Oncogene,2007,26(30)：4442-4452.

[4]Calin GA.Croce CM 2006 MicroRNA signatures in human cancers [J].Nature reviewa,6：857-866.

[5]Calin GA.Croce CM 2006 MicroRNA-cancer connection：the beginning of a new tale[J].Cancer research,66：7390-7394.

[6]Jeyaseelan K,Herath WB,Armugam A.MicroRNAs as therapeutic targets in human diseases[J].Expert opinion on therapeutic targets, 2007,11(8)：1119-1129.

[7]Iorio MV,Ferracin M,Liu CG,et al.MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer[J].Cancer research,2005,65：7065-7070.

[8]Hamm and SM.microRNAdetection comes of age[J].Nature Methods,2006,3(1)：12-13.

[9]Davis S,Lollo B,Freier S.Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides[J].Nucleic Acids Res,2006,34(8)：2294-2304.

Correlation study of the expression of miR-21 and miR-155 in the blood and tumor tissue of patients with breast cancer.

BIAN Guo-feng1,CHEN Ai-jun2.1.The First Clinical College of China Three Gorges University, Yichang,443003,Hubei,CHINA;2.The Third Department of General Surgery,the Central Hospital of Yichang City, Yichang 443003,Hubei,CHINA

ObjectiveTo evaluate the expression levels of miR-21 and miR-155 in the serum of breast cancer patients and healthy women by real-time quantitative PCR,compared with the variation trend of the expression level of miR-21 and miR-155 in tumor tissue samples.MethodsThe samples were collected from the intraoperative tumor tissue,adjacent tissue,and the peripheral blood of patients and from the peripheral blood of healthy women.The miR-21 and miR-155 obtained were detected by real time quantitative PCR.Then the relationship between the trend of miR-21 and miR-155 in serum and in tumor tissues was analyzed.ResultsThe expression levels of miR-21and miR-155 in adjacent tissues of breast cancer patients were significantly lower than those in tumor tissues.The expression levels of miR-21 and miR-155 in the serum of breast cancer patients were significantly higher than those of healthy women.ConclusionThe levels ofserum miR-21 and miR-155 can be used asbiomarkers forthe early diagnosisofbreastcancer.

MicroRNA;Breast cancer;Tumor marker;miR-21;miR-155

R737.9

A

1003—6350（2012）18—001—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.18.001

2012-03-11)

卞國奉(1985—)，男，湖北省宜昌市人，住院醫師，碩士。

*通訊作者：陳愛軍(1964—)，男，湖北省宜昌市人，碩士生導師，教授，研究方向：普外腫瘤。E-mail:chenaijun@163.net